檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC25A1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞體外放射敏感性的影響及其分子機(jī)制

師 盼，林重華，舒易方，瞿家權(quán)，宋淑亮*

(1.山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東 威海 264209；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科膽汁淤積肝病中心，重慶 400038；3.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像技術(shù)系，湖南 吉首 416000；4.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科放療中心，重慶400038)

食管癌是全球第七大常見癌癥，也是第六大癌癥死因，遺傳、煙草、酒精、熱飲、機(jī)械損傷、胃食管反流疾病、巴雷特食管、肥胖等因素是其高危因素[1]。與歐美國(guó)家比較，我國(guó)食管癌組織學(xué)類型[2]中食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的比例高，而食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)的比例低。放射治療(radiotherapy)[3]是不可手術(shù)的中晚期食管癌綜合治療的重要策略，然而即便采取包括根治性同步放化療、姑息性手術(shù)等綜合治療，局部晚期食管癌局控失敗率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍很高，5 年總的生存率約為20%，總體預(yù)后不良[4]。獲得性放療抵抗(radiotherapy resistance)[5]是指腫瘤初期對(duì)放療敏感但分割放療后短時(shí)間內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)和進(jìn)展的臨床現(xiàn)象，也被認(rèn)為是局部食管癌復(fù)發(fā)或治療失敗重要原因之一，并成為制約食管癌預(yù)后和療效改善的障礙。目前，大量研究提示[6]，乏氧、線粒體能量代謝狀態(tài)、線粒體膜通透性及電位改變、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和腫瘤干細(xì)胞特征與獲得性放射抵抗密切相關(guān)，但放射抵抗的確切機(jī)制仍不清楚。

線粒體溶質(zhì)載體家族25A1(solute carrier family 25 member 1，SLC25A1)[7]又稱為檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或三羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其缺失突變與人類疾病羥基戊二酸尿癥和肌無力綜合征相關(guān)。SLC25A1蛋白細(xì)胞亞定位于線粒體內(nèi)膜[7]，其主要功能是檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，參與線粒體氧化磷酸化及能量代謝。近年研究證實(shí)[8]，SLC25A1在多種腫瘤存在高表達(dá)，是p53突變體一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞乏氧耐受，可作為腫瘤預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。因此，本研究采用TCGA 腫瘤組織數(shù)據(jù)庫(kù)比較食管腺癌、食管鱗癌與癌旁組織的SLC25A1 基因表達(dá)差異，通過構(gòu)建放射抵抗和放射敏感食管鱗癌細(xì)胞系并證實(shí)放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞存在SLC25A1 表達(dá)上調(diào)，采用體外放射模型評(píng)估SLC25A1 敲低對(duì)食管癌細(xì)胞系放射敏感性的影響，并初步探討SLC25A1 參與放射抵抗的分子機(jī)制，為篩選放射增敏靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150 由中南大學(xué)高等研究中心細(xì)胞保藏室購(gòu)買，10%胎牛血清RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱，常規(guī)胰酶消化，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。放射抵抗的食管鱗癌細(xì)胞株[9]采用X 射線多次亞致死劑量暴露法建立。本研究采用的放射抵抗KYSE150-R 和對(duì)照組放射敏感KYSE150 細(xì)胞株均為多輪亞致死劑量的X射線照射后傳至第4～15代，并用體外放射克隆存活法鑒定。

1.1.2 試劑RPMI-1640 培養(yǎng)基為Gibco 公司產(chǎn)品；胎牛血清為以色列Biological Industries 生物有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、NP-40 細(xì)胞裂解液、Hoechst33258熒光染料溶液、0.5%結(jié)晶紫染料、ROS染色流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶和磷酸化酶抑制劑為美國(guó)Roche 公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000 脂質(zhì)體為美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；β-actin和SLC25A1單克隆抗體以及抗兔和抗鼠二抗均為美國(guó)Proteintech 公司產(chǎn)品，Phospho-Histone H2A.X(Ser139) 位點(diǎn)磷酸化和Phospho-DNA-PKcs(Ser2056)位點(diǎn)磷酸化及Histone H2AX 和DNA-PKcs 單克隆抗體均為美國(guó)CST公司產(chǎn)品。

1.1.3 質(zhì)粒及引物SLC25A1-shRNA 質(zhì)粒購(gòu)于山東維真生物公司，參考SCL25A1 的基因編號(hào)NM_005984；產(chǎn)品編號(hào)SH874543，提供4個(gè)不同干擾位點(diǎn)的shRNA質(zhì)粒及對(duì)照組Scramble shRNA，載體名稱為pLent-U6-GFP，大小約1 000 bp，具有U6，CMV，eGFP 元件及嘌呤霉素抗性，質(zhì)粒序列見表1。SLC25A1及GAPDH上下游引物見表2。

表1 SLC25A1 shRNA質(zhì)粒及對(duì)照Scramble shRNA質(zhì)粒序列

表2 SLC25A1和GAPDH基因上下游引物序列

1.1.4 儀器雙目倒置相差顯微鏡，產(chǎn)自日本奧林巴斯公司，CKX31 型；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，產(chǎn)自美國(guó)賽默飛公司；雙目倒置熒光顯微鏡，產(chǎn)自德國(guó)萊卡公司，DM-IL 型；流式細(xì)胞儀，產(chǎn)自美國(guó)BD 公司，F(xiàn)ACSVerse 型；醫(yī)用直線加速器，產(chǎn)自美國(guó)瓦里安公司，Clinac 2300 C/D 型，小型垂直電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，產(chǎn)自美國(guó)伯樂公司，Bio-Rad Mini-PROTEAN型。

1.2 方法

1.2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)差異表達(dá)基因分析通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)官方網(wǎng)站(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)及由阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校UALCAN 交互式網(wǎng)絡(luò)工具(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)[10]分析TCGA 腫瘤組學(xué)數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)要步驟如下：①通過TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)選擇“Esophageal carcinoma”全部下載所有可比的mRNA 表達(dá)譜、RNAseq 或基因表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)并進(jìn)行手工篩選；②采用UALCAN 交互式網(wǎng)絡(luò)工具選擇“Esophageal carcinoma”數(shù)據(jù)庫(kù)集并與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載文檔進(jìn)行比對(duì)，包括食管組織(包括巴雷特食管)組織及癌旁正常食管組織、食管腺癌、食管鱗癌3 種mRNA 表達(dá)譜、RNAseq 或基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)納入的分析，并比對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得組織的差異，最終確定納入研究的組織隊(duì)列；③在UALCAN 網(wǎng)站界面的Enter gene symbol(s)框中輸入SCL25A1，以及在TCGA dataset 下拉菜單輸入“Esophageal carcinoma”，選擇表達(dá)譜“Expression” 比 較， 獲 得Normal-vs-Primary 隊(duì) 列SLC25A1 的表達(dá)差異分布圖，包括納入樣本量、極值、中位數(shù)、四分位數(shù)及P 值，在下拉菜單的亞組分析選擇“Histology type”比較，獲得Normal-vs-Adenocarcinoma 和Normal-vs-Squamous-cell-carcinoma的表達(dá)差異分布圖、樣本量、極值、中位數(shù)、四分位數(shù)及P值。

1.2.2 放射克隆存活法分析細(xì)胞放射敏感性放射敏感細(xì)胞和放射抵抗細(xì)胞株常規(guī)6 孔培養(yǎng)板按3 種細(xì)胞密度接種(分別為500、1 000、2 000 個(gè)/孔)，待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)板上層覆蓋1.0 cm 補(bǔ)償膠，皮源距100 cm，等中心照射，深度d=2.5 cm，吸收率為200 cGy/min，分別暴露于燈光野假照射(Sham-radiation)，1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 Gy 的梯度劑量的X-射線下(6 MeV)，照射后繼續(xù)培養(yǎng)14～18 d，結(jié)晶紫染色，50個(gè)細(xì)胞以上克隆計(jì)數(shù)。按公式計(jì)算克隆效率和生存分?jǐn)?shù)：

以未經(jīng)X-射線照射細(xì)胞為對(duì)照。采用GraphPad Prism 5.0 軟件，按照線性二次方程模型S=e-aD-BD2擬合劑量反應(yīng)曲線，其中S 為生存分?jǐn)?shù)，a 和b 為常數(shù)，D 為劑量，按積分法計(jì)算存活曲線下面積(area under the curve，AUC)和放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)。

1.2.3 穩(wěn)定敲低SLC25A1 表達(dá)食管癌細(xì)胞系構(gòu)建取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE150-R 細(xì)胞，每孔10 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，完全培基細(xì)胞接種過夜后，RPMI-1640 培 養(yǎng) 基 洗 滌 六 孔 板5 次， 采 用250 μL Lipofectamin 2000 包被2.0 μg pLent-U6-GFP-SLC25A1 shRNA質(zhì)粒及對(duì)照組Scramble shRNA質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，8 h后更換完全培養(yǎng)基，24 h后依照TRIZOL法提取RNA，檢測(cè)4 種質(zhì)粒敲低SLC25A1 的效率，選擇敲低效率超過80%以上的兩個(gè)質(zhì)粒作為后續(xù)慢病毒感染質(zhì)粒。按照試劑說明書中慢病毒感染試劑操作步驟感染KYSE150-R 細(xì)胞，用于篩選的嘌呤霉素濃度為1.6 μg/mL，選取耐藥和表達(dá)綠色熒光的單克隆繼續(xù)篩選完全培基中加入0.8 μg/mL 嘌呤霉素進(jìn)行培養(yǎng)，并鑒定上述耐藥具有熒光的克隆，最終獲得2～3 株經(jīng)免疫印跡法鑒定的穩(wěn)定敲低SLC25A1 表達(dá)的KYSE150-R細(xì)胞。

1.2.4 Hoechst 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE150和KYSE150-R細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，完全培基細(xì)胞接種過夜后，次日開始給予常規(guī)分割放射(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1 次/d×5 d)處理細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞給予假照射處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集貼壁細(xì)胞，多聚甲醛冰上固定20 min，5 μg/mL Hoechst 33258 溶液重懸細(xì)胞避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察典型的凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上可出現(xiàn)染色質(zhì)固縮，核碎裂以及核發(fā)泡等改變。凋亡細(xì)胞百分比計(jì)算方法為：在5 個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野下選取200個(gè)細(xì)胞計(jì)算其中的凋亡細(xì)胞數(shù)目，重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)ROS 檢測(cè)法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE150和KYSE150-R細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，完全培基細(xì)胞接種過夜后，次日開始常規(guī)分割放射(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1次/d×5 d)處理細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞給予假照射處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集貼壁細(xì)胞，按碧云天公司ROS 流式檢測(cè)試劑盒操作說明，簡(jiǎn)要步驟如下按照1∶1 000稀釋加入的二 氯 雙 氫 熒 光 素 二 乙 酸 酯 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)染 色液，終濃度為10.0 μmol/L，避光孵育15 min，隨后采用無血清1 640 培養(yǎng)基洗滌3 次，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫印跡法加蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的NP-40 細(xì)胞裂解液處理待檢測(cè)細(xì)胞，于冰上裂解45 min，常規(guī)細(xì)胞刮取細(xì)胞；4 ℃，50 W 功率超聲2 s，125 000 g離心30 min，吸取上清，BCA法蛋白定量，常規(guī)煮沸變性5 min，樣品蛋白上樣量為每泳道60 μg，10% SDS-PAGE變性凝膠電泳，電泳條件：積層膠50 V，分離膠120 V恒定電壓電泳分離，全濕三明治法電轉(zhuǎn)條件：恒定電流100 mA，電轉(zhuǎn)移時(shí)間1.5 h，印跡膜為0.22 μm的PVDF膜。5%BSA室溫下封閉1 h，隨后分別加入下列不同稀釋比例的一抗4℃冰箱孵育過夜(β-actin一抗按1∶5 000稀釋；SLC25A1一抗按1∶500 稀釋；磷酸化H2A.X(Ser139)和磷酸化DNAPKcs(Ser2056)、H2AX、DNA-PKcs 均按1∶1 000 稀釋)，室溫下加入二抗孵育1.5 h(均按1∶5 000 稀釋)，加發(fā)光劑后壓片5～10 min，顯影定影3～5 min，采用300 dpi對(duì)膠片掃描導(dǎo)入條帶分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用頻數(shù)表示，均數(shù)兩兩比較采用SPSS 15.0 軟件行t 檢驗(yàn)，體外放射克隆存活曲線采用線性二次方程模型擬合；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)食管癌與正常組織SLC25A1 基因表達(dá)的差異

通過阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校UALCAN交互式網(wǎng)絡(luò)工具分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中食管癌組織與正常組織的SLC25A1基因表達(dá)水平的差異(圖1)。結(jié)果顯示，納入食管癌組織184例，正常食管組織11例。與正常食管組織比較，食管癌組織(不分組織類型)中SLC25A1 基因表達(dá)升高1.65 倍(P=1.64×10-4)；其中，食管腺癌升高1.63倍，食管鱗癌升高1.72倍(P均＜0.05)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)食管癌組織與正常組織SLC25A1基因表達(dá)水平差異

2.2 放射抵抗和放射敏感食管鱗癌細(xì)胞系SLC25A1基因差異表達(dá)

采用6 MeV X射線多輪亞致死劑量暴露法篩選并建立放射抵抗和放射敏感的食管鱗癌KYSE150-R 和KYSE150細(xì)胞株，并采用放射克隆存活實(shí)驗(yàn)線性二次方程靶模型驗(yàn)證細(xì)胞系放射敏感性。結(jié)果顯示，KYSE150-R 細(xì)胞株LQ 模型克隆存活曲線下面積(AUC=1.834)與對(duì)照組比較(AUC=1.536)上調(diào)(P＜0.05；SER2Gy=0.84)(圖2A、B)，提示成功構(gòu)建放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株及對(duì)照放射敏感細(xì)胞株。免疫印跡和qPCR 法對(duì)兩株細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組KYSE150 比 較， 放 射 抵 抗KYSE150-R 細(xì) 胞 株SLC25A1 蛋白和mRNA 水平表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05)(圖2C、D)。

圖2 放射抵抗食管癌細(xì)胞株與放射敏感細(xì)胞株SLC25A1基因表達(dá)水平差異

2.3 SLC25A1 穩(wěn)定敲低對(duì)放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響

首先構(gòu)建SLC25A1 穩(wěn)定改變的放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞，采用4 種SLC25A1 shRNA 質(zhì)粒及對(duì)照組Scramble shRNA 分別轉(zhuǎn)染KYSE150-R 細(xì)胞，qPCR 法檢測(cè)SLC25A1 mRNA 表達(dá)改變，結(jié)果證實(shí)SLC25A1 shRNA1 和SLC25A1 shRNA3 干擾效率超過70%，可作為有效干擾質(zhì)粒(圖3A)；采用SLC25A1-shRNA1 和SLC25A1 shRNA3 質(zhì)粒包裝慢病毒并感染細(xì)胞，成功構(gòu)建并免疫印跡法驗(yàn)證2 株穩(wěn)定敲低SLC25A1 的KYSE150-R細(xì)胞(圖3B)。

為了分析SLC25A1 基因在食管癌放射抵抗中的作用機(jī)制，采用多分割放射X-射線(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1 次/d×5 d)照射KYSE150-R/SLC25A1 KD 細(xì)胞株及對(duì)照KYSE150-R/Scramble shRNA-NC 細(xì)胞株，Hoechst染色凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)分析結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組[(17.94±5.20)%]比較，KYSE150-R/SLC25A1 KD細(xì)胞株凋亡率[(28.35±6.30)%]顯著增加1.58 倍(P＜0.05)(圖3C)。同時(shí)，放射克隆存活實(shí)驗(yàn)線性二次方程靶模型證實(shí)，與對(duì)照組比較(AUC=1.96)，KYSE150-R/SLC25A1 KD 細(xì)胞株LQ 模型克隆存活曲線下面積(AUC=1.61)顯著降低(P＜0.05；SER2Gy=1.22)(圖3D)。

圖3 SLC25A1基因穩(wěn)定敲低誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株凋亡增強(qiáng)放射敏感性

2.4 SLC25A1通過抑制DNA損傷修復(fù)誘導(dǎo)放射增敏

為了分析SLC25A1 基因是否通過調(diào)控ROS 水平誘導(dǎo)放射增敏的作用，采用多分割放射X-射線(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1 次/d×5 d)照 射KYSE150-R/SLC25A1 KD 細(xì)胞株及對(duì)照KYSE150-R/Scramble shRNA-NC 細(xì)胞株，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 水平結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，KYSE150-R/SLC25A1 KD細(xì)胞株ROS 水平降低了(65.3±14.3)%(P=0.007)(圖4A～B)。隨后，采用免疫印跡法分析敲低SLC25A1對(duì)放射誘導(dǎo)的DNA 損傷修復(fù)關(guān)鍵分子信號(hào)傳導(dǎo)的影響，結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組比較，KYSE150-R/SLC25A1 KD細(xì)胞株的磷酸化H2AX(Ser139)和磷酸化DNA-PKcs(Ser2056)水平顯著降低(圖4C)。

3 討 論

食管鱗癌是放化療敏感的惡性腫瘤，同步放化療是目前局部晚期不可手術(shù)切除的食管癌標(biāo)準(zhǔn)治療方案[3]。然而，放療靶病灶內(nèi)殘留生存的腫瘤細(xì)胞發(fā)生局灶復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤治療失敗，影響腫瘤患者預(yù)后，已成為臨床上腫瘤治療的棘手問題[2-3]。目前，放療靶區(qū)內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)的分子機(jī)制仍不清楚，而獲得性放射抵抗被認(rèn)為是其關(guān)鍵影響因素。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC25A1[7-8，11]通過調(diào)控檸檬酸的跨線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，具有保護(hù)線粒體損傷和通過自噬途徑抑制線粒體損耗的作用，在代謝活躍和高增殖的組織中參與維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生物能量生產(chǎn)，并參與調(diào)控ROS水平。本研究以我國(guó)發(fā)病率較高且放療作為主要治療方法瘤種——食管鱗癌為研究對(duì)象，以獲得性放射抵抗模型為切入點(diǎn)，采用國(guó)際通用的TCGA 腫瘤組織數(shù)據(jù)庫(kù)分析證實(shí)食管癌與正常組織存在SLC25A1表達(dá)上調(diào)，放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞存在SLC25A1表達(dá)上調(diào)，并采用體外放射模型初步證實(shí)下調(diào)SLC25A1表達(dá)通過抑制DNA損傷修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為進(jìn)一步篩選食管癌放射增敏分子靶點(diǎn)和臨床轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖4 穩(wěn)定敲低SLC25A1通過抑制DNA損傷修復(fù)誘導(dǎo)放射增敏

首先，本研究采用UALCAN交互式網(wǎng)絡(luò)工具分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中食管癌組織與正常組織的SLC25A1 表達(dá)差異，結(jié)果證實(shí)，與正常食管組織比較，食管癌組織、食管鱗癌組織、食管腺癌組織SLC25A1 基因mRNA 水平表達(dá)均顯著升高。隨后，我們采用多輪亞致死劑量暴露法成功建立放射抵抗和放射敏感對(duì)照組食管鱗癌細(xì)胞株(KYSE150-R 和KYSE150 細(xì)胞)。隨后進(jìn)一步證實(shí)，放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株存在SLC25A1蛋白表達(dá)水平和mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)。與SLC25A1 在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織的報(bào)道類似[7-8]，SLC25A1 在多種腫瘤中可能作為一種潛在癌基因參與腫瘤發(fā)生、惡性表型維持以及化療耐藥。結(jié)合本研究結(jié)果提示，SLC25A1 基因可能作為一種致癌基因參與食管癌發(fā)病和放射抵抗等惡性表型。在生理學(xué)功能方面溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC25A1 主要通過調(diào)控檸檬酸的跨線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并參與氧化磷酸化過程[12]，而在光子放射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和放射抵抗條件下SLC25A1 發(fā)揮何種功能仍未充分研究。為了進(jìn)一步分析SLC25A1 是否參與食管鱗癌放射抵抗，本研究成功構(gòu)建SLC25A1 敲低的放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株(KYSE150-R/SLC25A1 KD1 和KYSE150-R/SLC25A1 KD3)及對(duì)照組細(xì)胞株。通過穩(wěn)定敲低SLC25A1 表達(dá)分析放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及對(duì)食管鱗癌體外放射敏感性的影響，結(jié)果證實(shí)，敲低SLC25A1 表達(dá)可增加放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并部分逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞體外放射抵抗而誘導(dǎo)放射增敏。一般而言[13]，放射線及其誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的ROS 損傷DNA 等生物大分子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮放射治療作用。為了分析SLC25A1 是否通過ROS水平調(diào)控參與放射抵抗過程，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多分割亞致死劑量下放射抵抗細(xì)胞株中ROS水平。然而與預(yù)期相反，在多分割放射條件下，放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株敲低SLC25A1 基因表達(dá)并未如預(yù)期ROS水平升高而是出現(xiàn)ROS水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的輕微降低(P＜0.05)(圖4)。我們推測(cè)出現(xiàn)這種差異性現(xiàn)象的原因，ROS水平在不同條件下對(duì)細(xì)胞的作用存在爭(zhēng)議[14]。一方面，模型選擇上放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株在基線水平具有耐受多分割光子射線能力，反映出放射抵抗細(xì)胞株耐受高水平ROS所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用；另一方面亞致死劑量照射可激活細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力具有抵抗凋亡的作用。隨后，采用免疫印跡法分析SLC25A1敲低對(duì)放射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵分子信號(hào)的影響，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，敲低SLC25A1 基因表達(dá)通過抑制DNA損傷修復(fù)能力誘導(dǎo)放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株。值得注意的，大量研究證實(shí)[15-16]，ROS 水平對(duì)細(xì)胞的作用存在差異，亞致死劑量放射線誘導(dǎo)適度的ROS水平參與腫瘤放射抵抗而過量的ROS水平通過細(xì)胞死亡配體信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而低水平的ROS 具有維持適度氧化應(yīng)激作用發(fā)揮相應(yīng)的生理功能。人類SLC25A1 的同源果蠅scheggia(sea)編碼Sea 蛋白的突變，通過影響檸檬酸鹽從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，敲低Sea 可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，而通過短干擾RNA(siRNA)處理的人類原代成纖維細(xì)胞，SLC25A1 表達(dá)敲低導(dǎo)致染色體斷裂和組蛋白乙酰化缺陷，提示SLC25A1具有維護(hù)染色體完整性方面具有進(jìn)化保守作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)通過在放射抵抗食管癌細(xì)胞株敲低SLC25A1表達(dá)聯(lián)合X-放射線暴露處理，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。我們推測(cè)敲低SLC25A1 通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)染色體斷裂和組蛋白乙酰基化缺失和抑制DNA 損傷修復(fù)等方面，破壞染色體完整性，增強(qiáng)X-射線誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞死亡，具有逆轉(zhuǎn)放療抵抗的潛力。因此，本研究提示SLC25A1 在亞致死劑量X 射線暴露下通過維持細(xì)胞ROS水平，增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力，誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡作用，而下調(diào)SLC25A1 表達(dá)具有克服放射抵抗的作用的潛力，但需要評(píng)估氧化磷酸化和氧耗率差異并采用裸鼠移植瘤放射動(dòng)物體內(nèi)模型進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)比較食管癌與正常組織差異比較證實(shí)食管癌組織存在SLC25A1 表達(dá)上調(diào)；多輪亞致死劑量暴露法構(gòu)建的放射抵抗食管鱗癌細(xì)胞株也存在SLC25A1 表達(dá)上調(diào)；SLC25A1 可能作為一種參與放射抵抗和腫瘤發(fā)病的候選癌基因。放射抵抗食管癌細(xì)胞系敲低SLC25A1表達(dá)，通過下調(diào)ROS水平抑制DNA 損傷修復(fù)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮放射增敏作用。SLC25A1 可作為一種潛在的食管鱗癌放射增敏分子靶點(diǎn)。