紅藻提取物對體外瘤胃發(fā)酵特性、產(chǎn)甲烷和微生物生長的影響

郭善軍

（達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州 635000）

在過去10年里，人為溫室氣體排放量迅速上升，值得注意的是，甲烷氣體的全球變暖潛力是二氧化碳的25倍，但自19世紀(jì)初以來，其濃度增加了兩倍。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是甲烷排放的主要來源，特別是反芻動(dòng)物養(yǎng)殖，其甲烷排放量占全球總量的25%（周艷等，2018）。因此，在不影響瘤胃功能的前提下，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)家對減少甲烷排放非常感興趣。部分飼料添加劑在減少動(dòng)物溫室氣體排放方面具有很大潛力，同時(shí)也可以改善飼料利用率，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能（Grainger和Beauchemin，2011）。潛在的飼料添加劑包括鹵化類似物、單寧素和一系列植物化合物，如精油、皂苷和各種次生代謝產(chǎn)物。藻類是一種很具前景的飼料添加劑，有各種各樣的形式，根據(jù)大小可分為微藻類與大藻類，根據(jù)主要色素可分為綠色、紅色或棕色，其中大藻類是代謝必需化合物的豐富來源，包括各種礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)、脂類和多糖，因此，大藻類添加劑可以提高反芻動(dòng)物飼料質(zhì)量、生長速度、飼料轉(zhuǎn)化效率，降低反芻動(dòng)物腸道甲烷排放（Bozic等，2009）。但很少有研究確定藻類飼料添加劑如何影響反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵特性和甲烷減排。因此，本研究旨在探討紅藻提取物對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和甲烷排放的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃體外發(fā)酵設(shè)計(jì) 選擇一只體重為（450±30）kg帶有瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，試驗(yàn)動(dòng)物可以自由舔飼礦物質(zhì)維生素鹽塊和飲水。每天在早上9點(diǎn)和下午5點(diǎn)用苜蓿草和濃縮料搭配（60∶40）的全混合日糧飼喂1次，飼喂量為奶牛體重的2%。早上飼喂前收集瘤胃液，四層紗布過濾后用人工唾液稀釋，保存在39℃。將15 mL的混合物厭氧分配到50 mL的血清瓶中，其中含有0.3 g苜蓿草底物和紅藻提取物。用鋁蓋丁基橡膠塞在純氮?dú)庵袇捬趺芊猓糜趽u瓶箱中，體外發(fā)酵試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，一式三份，使用126個(gè)血清瓶（6次處理×7次孵育×3次重復(fù)）。

1.2 瘤胃發(fā)酵特征和微生物生長速度 使用可拆卸壓力傳感器和數(shù)字可讀電壓表，用氣相色譜法測定樣品中的總氣體產(chǎn)量，使用羧酸-1006 Plot毛細(xì)管柱TCD檢測器測量甲烷和二氧化碳含量。然后取無蓋血清瓶對培養(yǎng)基進(jìn)行采樣，進(jìn)行pH、氨氮和揮發(fā)性脂肪酸分析。用紫外/可見分光光度計(jì)在630 nm處測定。參考Denis等（2010）研究方法分析干物質(zhì)體外瘤胃發(fā)酵降解率。發(fā)酵周期結(jié)束時(shí)以3000×rpm離心樣品3 min，去除飼料顆粒。上清以14000×rpm再次離心3 min，得到蛋白和葡萄糖分析的最終上清樣品。部分上清液采用考馬斯亮藍(lán) G-250染色，在595 nm處分光光度法測定OD蛋白含量。測量取200 μ L上層清液加入600 μ L DNS、沸水孵育5 min，葡萄糖濃度為595 nm處的OD值。用磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）將離心得到的顆粒再洗滌4次，然后在550 nm處進(jìn)行OD測量，以評估微生物的生長速度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SAS一般線性模型程序進(jìn)行分析，各處理間均值差異采用Duncan's進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，顯著性為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃體外發(fā)酵特征 由表1可知，與對照組相比，紅藻提取物組提高了發(fā)酵6、9、12和72 h的pH（P＜0.05），處理1組顯著提高了6和12 h的pH（P＜0.05）。處理組較對照組顯著降低了瘤胃體外發(fā)酵3和6 h氣體產(chǎn)量（P＜0.05），但處理2組顯著提高了24和72 h的氣體產(chǎn)量（P＜0.05）。除了處理4組在72 h顯著降低了干物質(zhì)損失率外（P＜0.05），對照組與其他處理組對干物質(zhì)損失率無顯著影響（P＞0.05）。

由表2可知，紅藻提取物組較對照組顯著降低了瘤胃體外發(fā)酵12和24 h甲烷排放量（P＜0.05），但處理3組較對照組顯著提高了9 h二氧化碳排放量（P＜0.05）。紅藻提取物組較對照組顯著提高了9 h氨氮排放量（P＜0.05）。

表1 不同紅藻提取物對瘤胃微生物體外發(fā)酵的影響

表2 不同紅藻提取物對瘤胃發(fā)酵甲烷、二氧化碳和氮排放的影響

由表3可知，紅藻提取物組改善了12和24 h瘤胃發(fā)酵乙酸產(chǎn)量（P＜0.05）。瘤胃體外發(fā)酵12 h 后紅藻提取物組較對照組顯著提高了丙酸產(chǎn)量（P＜0.05），同時(shí)也顯著降低了乙酸和丙酸比值（P ＜ 0.05）。

表3 不同紅藻提取物對瘤胃乙酸和丙酸含量的影響

2.2 瘤胃微生物生長速度、蛋白質(zhì)和葡萄糖濃度 由表4可知，與對照組相比，紅藻提取物組顯著降低了6 h瘤胃微生物的生長速度（P＜0.05），但處理1組顯著提高了24 h瘤胃微生物生長速度（P＜0.05）。此外，除了處理2和3組外，其他處理組較對照組均顯著提高了瘤胃發(fā)酵9 h的蛋白質(zhì)濃度（P＜0.05）。處理3組在瘤胃發(fā)酵3 h時(shí)降低了葡萄糖濃度（P＜0.05），但處理1和2組在24 h、處理3組在48 h均顯著提高了葡萄糖濃度（P＜ 0.05）。

表4 不同紅藻提取物對瘤胃微生物生長速度、蛋白質(zhì)和葡萄糖濃度的影響

3 討論

總的來說，在紅藻提取物處理組中，pH始終保持在6.12～7.47之間。有趣的是，對照組發(fā)酵后pH最低，這表明添加紅藻提取物在微生物發(fā)酵過程中創(chuàng)造更堿性的環(huán)境。由于瘤胃微生物活性的理想pH在5.0～7.8之間，所以海藻提取物可能有負(fù)面影響（Ha等，2005）。紅藻提取物增加了總氣體產(chǎn)量，而干物質(zhì)降解率沒有任何差異。此外，所有紅藻提取物處理組的總產(chǎn)氣量僅在24和72 h孵育時(shí)顯著高于對照組，這暗示了一種提高飼料效率的策略。雖然利用陸生植物來調(diào)控腸道甲烷排放已被廣泛研究，但本研究證明了紅藻提取物可以有效降低體外甲烷排放，改變瘤胃微生物多樣性，這與Dubois等（2013）的研究結(jié)果一致。

紅藻提取物顯著降低了6 h微生物生長速率，但在24 h孵育后增加，這種模式可能是因?yàn)榱鑫肝⑸镌诘?小時(shí)適應(yīng)了不斷變化的環(huán)境條件，并在24 h成指數(shù)生長。48 h后養(yǎng)分枯竭，可能會(huì)抑制微生物生長。此外，我們還觀察到，微生物生長速率越高的紅藻提取物處理組總產(chǎn)氣量越高，pH越低，這一結(jié)果與Ha等（2005）的研究一致，即瘤胃微生物生長速率與總產(chǎn)氣量和發(fā)酵密切相關(guān)。盡管瘤胃氨濃度隨飼料蛋白質(zhì)比例和降解速率變化而變化，使用苜蓿草為唯一底物導(dǎo)致氨濃度沒有顯著差異（除了6 h）。維持瘤胃微生物增長的最適氨濃度為8 mg/dL，而當(dāng)氨濃度≥140 mg/dL時(shí)會(huì)抑制微生物生長（Ha等，2005），同時(shí)，維持最佳氨濃度可以提高大多數(shù)瘤胃微生物的蛋白質(zhì)合成，但這兩個(gè)變量不相關(guān)。總的來說，觀察到的氨濃度為1.90～30.80 mg/dL時(shí)是瘤胃正常發(fā)酵的一個(gè)強(qiáng)有力的指標(biāo)，沒有顯示出紅藻提取物具有負(fù)面影響。反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵釋放的揮發(fā)性脂肪酸是主要終產(chǎn)物，而不是葡萄糖。本研究發(fā)現(xiàn)，丙酸在12和24 h瘤胃發(fā)酵后顯著增加，葡萄糖濃度在24和48 h相應(yīng)增加，這一結(jié)果與丙酸是最豐富的葡萄糖生成基質(zhì)（Larsen 和 Kristensen，2009）。

4 結(jié)論

紅藻提取物是一種可行的飼料添加劑，可以提高反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量，降低乙酸和丙酸比值，減少甲烷排放。但還需進(jìn)一步評估紅藻提取物對反芻動(dòng)物采食量、飼料利用效率和甲烷減排的影響及其機(jī)理。