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    魚蝦中喹乙醇及其代謝標示物的同步檢測

    2020-04-08 09:29:52馬瑞欣蘇歡歡周凡李雪萍王曉靜
    河北漁業(yè) 2020年2期
    關(guān)鍵詞:羧酸串聯(lián)乙腈

    馬瑞欣 蘇歡歡 周凡 李雪萍 王曉靜

    摘要:建立了液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)同步檢測魚蝦中的喹乙醇(OLA)及其代謝標示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的方法。樣品用0.1 mol/L的鹽酸37 ℃水解16 h,水解液乙腈萃取,正己烷去脂,HLB固相萃取柱凈化,LC-MS/MS分析,內(nèi)標法定量。結(jié)果表明,OLA和MQCA在1.00~200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性,相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,方法檢出限為0.50 μg/kg,定量限為1.00 μg/kg。在1.00、2.00、10.0 μg/kg加標水平下,OLA平均回收率為84.5%~107.0%,MQCA平均回收率為74.0%~106.0%,相對標準偏差(RSD)均小于10%。該方法靈敏度高,操作簡單,可適用于魚蝦肌中喹乙醇及其代謝標示物的同步檢測。

    關(guān)鍵詞:喹乙醇;3-甲基喹噁啉-2-羧酸;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS);魚蝦;同步檢測

    喹乙醇又名酰胺醇,商品名有快育諾、倍育諾、快育靈等,具有廣譜抗菌和促進生長的雙重作用。該藥物曾被作為添加劑廣泛用于畜、禽、魚、蝦飼料中[1]。喹乙醇在可食動物源性食品中的殘留對人類有潛在的三致性[2-3],其在美國和歐盟都被禁止用作飼料添加劑。2005版《中國獸藥典》明確規(guī)定,喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。2018年1月11日頒布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第2638號公告規(guī)定停止在食品動物中使用喹乙醇。3-甲基喹噁林-2-羧酸(MQCA)是喹乙醇主要代謝物之一,其在體內(nèi)相對穩(wěn)定,被定為喹乙醇在動物體內(nèi)代謝的殘留標示物[4]。

    目前水產(chǎn)品中喹乙醇及其代謝標示物的定量檢測方法主要有液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。這些檢測方法中OLA和MQCA的前處理和上機分析是分別進行的,不能通過前處理同時提取OLA和MQCA。關(guān)于OLA和MQCA同步檢測的文章也有報道[12-13],但由于MQCA與蛋白緊密結(jié)合,僅采用酸溶液提取很難將MQCA充分提取出來,而且水產(chǎn)品的酸提取液比較渾濁,直接通過固相萃取柱困難,造成可操作性差。液相色譜法使用紫外檢測器或DAD檢測器,檢測水產(chǎn)品中的MQCA時干擾較大,靈敏度低且易出現(xiàn)假陽性。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜選擇性強、靈敏度高,在定性定量檢測方面具有相當?shù)膬?yōu)勢,因此本文建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同步測定魚蝦中的OLA和MQCA的方法,可對OLA和 MQCA同步進行前處理和檢測,減少了實驗步驟;同時對前處理方法進行了改進和優(yōu)化,可操作性增強。

    1材料與方法

    1.1儀器、試劑與材料

    LC-20AD液相色譜(日本島津);QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX );十萬分之一電子天平(賽多利斯);百分之一電子天平(賽多利斯);SHA-B雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器(上海梅香儀器有限公司);平行蒸發(fā)儀(瑞士BUQI);Milli-Q超純水儀(美國Millipore);TDZ5-WS離心機(湖南湘儀);MS3渦旋混合器(IKA);JYS-A8000絞肉機(九陽)。

    喹乙醇(OLA,純度97.89%,Dr. Ehrenstorfer);喹乙醇-D4(OLA- D4,純度(99.1±02)%,WiTEGA); 3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA,純度97.0%,Dr. Ehrenstorfer) ;3-甲基喹噁啉-2-羧酸-D4(MQCA-D4,純度(100±2.0)%,BePure)。乙腈和甲醇(HPLC Grade,Merck);甲酸(HPLC Grade,DIKMA);鹽酸(優(yōu)級純,北京化工廠);氯化鈉(GR,國藥);HLB固相萃取柱:3 mL,60 mg(waters);濾膜:0.2 μm GHP(PALL),實驗用水為超純水。

    1.2試樣制備

    魚去鱗、去皮,沿脊背取肌肉部分;蝦去頭、殼,取肌肉部分,切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后混勻,絞肉機絞碎,裝入潔凈容器中,密封,-18℃以下冷凍保存。

    1.3樣品前處理方法

    稱取樣品5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心試管中,準確加入1.00 mg/L的混合內(nèi)標中間液50 μL,渦旋混合均勻,加入15 mL 0.1 mol/L鹽酸,渦旋混勻2 min ,置于37 ℃水浴避光振蕩16 h,取出冷卻至室溫,加入5 g氯化鈉,15 mL乙腈,渦旋振蕩2 min,4 000 r/min離心5 min,取上層乙腈層至蒸發(fā)管中,再加入10 mL乙腈萃取一次,合并乙腈層,40 ℃蒸去乙腈。加入3 mL水洗滌蒸發(fā)管內(nèi)壁殘渣,溶液轉(zhuǎn)入15 mL離心試管中,再用3 mL水洗滌一次,合并溶液。溶液中加入5 mL正己烷,渦旋振蕩30 s,4 000 r/min離心5 min,棄去上層正己烷,再加入5 mL正己烷重復(fù)操作一次。下層溶液待凈化。

    HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸活化后,加入待凈化溶液, 不抽真空,讓其在重力作用下自然通過固相萃取柱,用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗,抽干,加入 3 mL甲醇洗脫,收集洗脫液于10 mL試管中,40 ℃氮氣吹干。加入1.00 mL水溶解,渦旋1 min,過0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

    1.4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

    液相色譜條件:色譜柱phenomenex Kinetex C18(100×2.1 mm, 2.6 μm),柱溫40 ℃,流速0.5 mL/min,進樣量5 μL,流動相A為0.15%(V/V)甲酸水溶液,B為0.15%(V/V)甲酸甲醇溶液。梯度洗脫程序:0~1 min,5%B;1~3 min,5%B~90%B;3~4 min,90%B;4~4.1 min,90%B~5%B;4.1~7 min,5%B。

    質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)掃描(MRM)正離子模式,噴霧電壓5 500 V,氣簾氣30 PSi, 碰撞氣Medium;溫度550 ℃;霧化氣:55 PSi;輔助加熱氣:55 PSi。質(zhì)譜條件及參數(shù)見表1。表1多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜條件及參數(shù)

    1.5標準溶液配制

    用十萬分之一電子天平稱取適量標準物質(zhì),用甲醇溶解并定容,配制成100 mg/L標準儲備液,-18 ℃以下避光保存。分別取適量標準儲備液,用甲醇分別稀釋成1.00 mg/L的OLA和MQCA的混合標準中間液、1.00 mg/L的OLA- D4和MQCA-D4混合內(nèi)標中間液,-18 ℃以下避光保存。

    取混合標準中間液和混合內(nèi)標中間液,用水稀釋成1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 μg /L的標準系列,內(nèi)標為50.0 μg /L。

    2結(jié)果與討論

    2.1樣品前處理條件的建立

    MQCA含有-COOH,易與蛋白質(zhì)結(jié)合,可采用酸水解[7]、酶水解[9-11]、堿水解[14-17]的方法使MQCA游離出來。采用酸水解的方法可使MQCA保持分子形式,有利于后續(xù)步驟中MQCA和OLA進入乙腈層;OLA比較穩(wěn)定,質(zhì)譜圖中子離子m/z 143.1和m/z 212.1信號比較強,干擾少,酸水解對OLA的提取和穩(wěn)定性無明顯影響。本文比較了 0.1 mol/L l、0.2 mol/L、2 mol/L的鹽酸水解16 h后的檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)酸的濃度越高,有些樣品(如對蝦)水解過程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象,質(zhì)譜圖中MQCA子離子m/z 144.9和m/z 142.9強度低、干擾大,造成回收率不穩(wěn)定;而采用0.1 mol/L的HCl水解16 h后,樣品成為均一的懸濁液, m/z 144.9和m/z 142.9信號較高,干擾小,回收率穩(wěn)定。參考相關(guān)文獻[18],本實驗確定水解條件為0.1 mol/L的鹽酸,37℃水浴避光振蕩16 h。

    由于MQCA分子量小,離子碎片信息少,且LC-MS/MS檢測時干擾多,本實驗采用乙腈萃取、正己烷去脂和HLB固相萃取柱凈化的方式對樣品提取液進行凈化。利用基質(zhì)加標溶液對凈化過程中使用淋洗液的種類、濃度和體積進行了試驗,發(fā)現(xiàn)用水淋洗時OLA有損失,10%的甲醇淋洗時OLA和MQCA均損失較多,故采用5%甲醇進行淋洗。使用3 mL 5%甲醇淋洗后,對蝦樣品中MQCA的干擾峰仍較強,使用6 mL 5%甲醇淋洗后,干擾峰明顯變?nèi)?,故使? mL 5%甲醇進行淋洗。試驗發(fā)現(xiàn)3 mL甲醇能充分將OLA和MQCA洗脫下來,故最后洗脫采用3 mL甲醇。

    乙腈萃取時,水解液中加入氯化鈉,增加水溶液的密度,有助于水相和乙腈的分層。通過萃取,減少了水溶性雜質(zhì)的干擾和乙腈蒸發(fā)過程中出現(xiàn)爆沸的情況。樣品溶液經(jīng)過乙腈萃取,水復(fù)溶,正己烷去脂處理后,溶液澄清,HLB柱凈化時過柱通暢,柱子不會堵塞,進一步增強了實驗的可操作性。

    2.2流動相的選擇

    流動相中加入甲酸,可提高目標物子離子信號強度;加入乙酸銨對MQCA的m/z 142.9離子有增強作用,但對MQCA-D4的m/z 149.0和MQCA的m/z 144.9信號強度有明顯抑制作用;采用梯度洗脫,可增加柱效和分離度。故選擇015%甲酸水溶液和0.15%甲酸甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫。

    2.3線性范圍

    OLA以O(shè)LA-D4為內(nèi)標,MQCA以MQCA-D4為內(nèi)標;以面積比為縱坐標,以濃度比為橫坐標繪制校準曲線。由圖1可以看出,OLA和MQCA在1.00 μg /L~200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性,相關(guān)系數(shù)r大于0.999。標準溶液的OLA和MQCA多反應(yīng)掃描質(zhì)量色譜圖見圖2。

    2.4檢出限和定量限

    實驗選擇草魚、鯉魚、金鱒、南美白對蝦、中國對蝦等空白樣品,通過空白樣品添加標準溶液制得0.50、1.00、2.00、10.0 μg/kg的加標樣品,每個樣品均采用四梯度三平行進行實驗,按1.3進行前處理,1.4進行上機測試,標準曲線法進行定量。由表2和表3中數(shù)據(jù)可以看出,在0.50 μg/kg的添加量的情況下,信噪比大于等于3,但有些品種回收率低于70.0%,RSD大于15%,因此確定OLA和MQCA的檢出限為0.50 μg/kg;在1.00 μg/kg添加量的情況下,OLA回收率在845%~107.0%之間,RSD≤7.6%;,MQCA回收率在77.1%~106.0%之間,RSD≤5.5%,因此確定OLA和MQCA的定量限為1.00 μg/kg。

    2.5回收率

    表2數(shù)據(jù)表明在1.00~10.0 μg/kg的添加范圍內(nèi),OLA回收率在84.5%~107.0%之間,標準偏差RSD≤8.0%;批間標準偏差RSD≤91%,見表4。表3數(shù)據(jù)表明在1.00~10.0 μg/kg的添加范圍內(nèi),MQCA回收率在740%~106.0%之間,標準偏差RSD≤9.9%;批間標準偏差RSD≤14%,見表5。典型樣品的OLA和MQCA多反應(yīng)掃描質(zhì)量色譜圖見圖3和圖4。

    2.6實際樣品檢測

    采用所建立的方法對市場上采集的羅非魚、中國對蝦、鯉魚、草魚、大菱鲆和南美白對蝦6個品種共計32個樣品進行檢測,均未檢出喹乙醇及其代謝標志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸。

    3結(jié)論

    本文建立了魚蝦中喹乙醇和其代謝標志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸同步檢測的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法,該方法喹乙醇和其代謝標志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟完全相同,實驗前處理可操作性強,準確度、精密度和檢出限等滿足檢測方法學(xué)的要求,可作為檢測魚蝦中是否使用喹乙醇的定性、定量方法。

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    Simultaneous determination of olaquindox and its metabolic

    marker in fish and shrimp

    MA Ruixin1,2,SU Huanhuan1,2,ZHOU Fan1,2,LI Xueping1,2,WANG Xiaojing

    (1.Hebei Provincial Center for Fisheries Technology Extension, Shijiazhuang 050035,China;

    2.Hebei Inspection and Examination Center for Aquatic Products Quality, Shijiazhuang 050035,China)

    Abstract:A liquid chromatography –tandem mass spectrometric method was developed to determine olaquindox (OLA) and its metabolic marker 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA)simultaneously in fish and shrimp . Sample was hydrolyzed with 0.1 mol/L hydrochloric acid for 16 h at 37 ℃, the hydrolytic solution was extracted with acetonitrile, defatted with n-hexane and purified with HLB solid-phase extraction cartridge, detected by liquid chromatography –tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The quantification was done by internal standard method. The analysts showed good linearity within the range 1.00~200 μg/L. The correlation coefficient (r) was greater than 0.999. The limit of detection was 0.50 μg/kg and the limit of quantitation was 1.00 μg/kg. At the three spiked levels of 1.0,2.0 and 10.0 μg/kg, the average recoveries of OLA were in range 845%~107.0% and MQCA in range 74.0%~106.0%. The relative standard deviations were below 10%. The proposed method is sensitive and easy to operate, it is suitable for detection of OLA and MQCA in fish and shrimp muscle tissues.

    Key words:olaquindox (OLA); 3-methylquinoxaline-2-carboxylic acid (MQCA); liquid chromatography –tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); fish and shrimp

    (收稿日期:2020-02-06)

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