表觀擴(kuò)散系數(shù)與缺氧誘導(dǎo)因子-1α、核因子-κB在布加綜合征大鼠模型中的相關(guān)性初探

朱楠，張?zhí)鹛穑傻吕?/p>

（1.安徽省五河縣人民醫(yī)院 影像科，安徽 蚌埠 233300；2.安徽省立醫(yī)院 介入放射科，安徽 合肥230001）

布加綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）是肝靜脈（hepatic vein，HV）和（或）其開口以上的下腔靜脈（inferior vena cava，IVC）阻塞導(dǎo)致的淤血性肝損傷，若不及時治療，最終可進(jìn)展為肝硬化[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是調(diào)節(jié)BCS病理損傷的重要因子，其在BCS病程中參與調(diào)節(jié)肝星型細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、微循環(huán)灌注等[3-4]，這些均影響細(xì)胞內(nèi)外水分子彌散，理論上可早于肝臟形態(tài)學(xué)變化而被表觀擴(kuò)散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）檢測[5]。已有報道ADC值在評估脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝損傷中的價值[6]，但目前在BCS中的研究報道較少。因此，本研究參照既往文獻(xiàn)建立大鼠BCS動物模型[4]，動態(tài)檢測IVC結(jié)扎后肝臟ADC值與HIF-1α、NF-κB的變化，初步探討其在BCS肝損傷中的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：20170104），自安徽省立醫(yī)院動物實驗中心購買體質(zhì)量235～305 g的健康雄性SD大鼠135只[許可證號：SCXK（蘇）2005-0001]，在12小時明/暗交替光照下，溫度15～25 ℃，濕度50%～60%條件下清潔飼養(yǎng)。

3F微導(dǎo)管（日本泰爾茂），RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific公司），ECL超敏發(fā)光試劑盒（Thermo公司），HIF-1α、NF-κB一抗均為兔抗1:300稀釋（ZSbio公司），PBS液（ZSbio公司），β-Actin（Santa Cruz公司），PicTureTM檢測試劑（Zymed公司），山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購自ZSbio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及BCS模型制備：按數(shù)字表法將135只大鼠隨機(jī)分為3組：正常組15只；模型組和假手術(shù)組各60只，分為術(shù)后1、4、8、12周4個亞組，每亞組15只。大鼠BCS模型制備：常規(guī)消毒麻醉后，于劍突下正中開腹分離肝鐮狀韌帶，暴露肝后段IVC，平行緊貼IVC以3 F微導(dǎo)管，并以0號線環(huán)繞結(jié)扎后抽出，逐層縫合關(guān)腹（見圖1）。假手術(shù)組不結(jié)扎肝后段IVC，其他過程同模型組。正常組僅常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理，本研究參考同類研究動物實驗設(shè)計[7-8]，正常組僅觀察研究終點12周這個時間點，該組所有時間點相關(guān)病理生理數(shù)據(jù)均用12周的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖1 模型組結(jié)扎IVC

1.2.2 MRI掃描及DSA：MRI掃描：正常組于造模后第12周，模型組及假手術(shù)組分別于實驗后1、4、8、12周隨機(jī)取9只大鼠，常規(guī)消毒麻醉后，仰臥位腹部加壓固定于腕關(guān)節(jié)線圈中心，以GE HDXT-1.5T磁共振機(jī)行常規(guī)T1WI、T2WI序列檢查及仰臥軸面DWI檢查。掃描參數(shù)為TR 1 250 ms，TE 65 ms，F(xiàn)OV 55 mm×55 mm，層間距0.2 mm，層厚3.0 mm，反轉(zhuǎn)角90°，激勵次數(shù)8，矩陣192×192。b值取800 s/mm2，自旋回波-回波平面成像加脂肪抑制。測量各組肝臟ADC值，ROI大小約15～20 mm2，盡量避開膽管、血管及肝臟邊緣，分別在肝左、右葉共取2個ROI測得數(shù)值的平均值做進(jìn)一步分析。DSA：各組大鼠于任意一側(cè)下肢消毒、鋪巾，以21 G靜脈留置針穿刺股靜脈，注射對比劑觀察IVC血流情況。

1.2.3 HE及免疫組化：正常組于造模后第12周，模型組及假手術(shù)組分別于術(shù)后1、4、8、12周行MRI檢查后，取MRI測量ROI相應(yīng)層面的新鮮肝組織適量，用10%福爾馬林固定24 h，石蠟包埋，制作組織切片，用于HE、免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5～10 min后PBS沖洗。滴加一抗，室溫孵育30～60 min后PBS沖洗。滴加通用型IgG抗體（Fab段）-HRP多聚體，室溫孵育10～20 min后PBS沖洗，應(yīng)用DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，采用已知陽性片作為陽性對照，陽性表達(dá)為結(jié)構(gòu)清晰的細(xì)胞胞漿棕黃染色。

1.2.4 Real-time PCR：肝組織液氮研磨后加入1 mL TRIzol勻漿，嚴(yán)格按照說明書步驟提取總RNA，提取出的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行Real-time PCR檢測。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40個循環(huán)。引物序列：β-actin上游序列：5′-CCCATC TATGAGGGTTACGC-3′，下游序列：5′-TTTAATGTC ACGCACGATTTC-3′；HIF-1α上游序列：5′-TGACCA CTGCTAAGGCATCA-3′，下游序列：5′-GGCTCCTT GGATGAGCTTTG-3′；NF-κB上游序列5′-AAGATCT GCCGAGTAAACCG-3′，下游序列：5′-TCCCGTGAA ATACACCTCAA-3′；基因相對表達(dá)量以2-△△Ct計算。

1.2.5 Western blotting：肝組織細(xì)胞裂解、離心后收集上清液，按照1:4加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，冷卻到室溫，上樣到SDSPAGE膠加樣孔內(nèi)，每孔5～20 μL。濃縮、分離后300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。漂洗5 min，室溫封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜，加入洗滌液（PBST），每次10 min，共3次，相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。加入PBST洗滌液，每次10 min，共3次。使用ECL試劑盒檢測蛋白，以Image J軟件分析條帶灰度值，相對表達(dá)量依照內(nèi)參照結(jié)果計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，同一時間點各組ADC值、HIF-1α、NF-κB比較采用單因素方差分析；模型組、假手術(shù)組組內(nèi)各亞組比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用LSD檢驗。ADC與HIF-1α、NF-κB相關(guān)性分析采用以Pearson法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCS模型大鼠建模情況

正常組存活15只；假手術(shù)組術(shù)后1、4、8、12周亞組分別存活15、14、15、15只；正常組及假手術(shù)組活動如常、反應(yīng)機(jī)警，DSA均無陽性表現(xiàn)。模型組術(shù)后1、4、8、12周亞組分別存活14、13、14、13只，活動逐漸減少、反應(yīng)遲鈍，毛色灰暗，存活大鼠均成功建立BCS模型，肝后段IVC管腔變窄，遠(yuǎn)端擴(kuò)張，4周后逐漸見側(cè)支循環(huán)形成（圖2）。

圖2 模型組12周DSA圖：肝后段IVC管腔閉塞（紅箭），遠(yuǎn)端擴(kuò)張，見廣泛側(cè)支循環(huán)形成（黃箭）

2.2 BCS模型大鼠MRI表現(xiàn)

各組大鼠常規(guī)MRI T1WI掃描肝實質(zhì)信號均勻，肝表面光整（圖3A～C）。正常組與假手術(shù)組ADC值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；正常組ADC值均高于模型組（P＜0.05）；模型組與假手術(shù)組ADC值整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，隨后兩兩比較，模型組均低于同一時間的假手術(shù)亞組（P＜0.05），見表1。

模型組ADC值隨時間進(jìn)展先下降后升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）；隨后各亞組間兩兩比較，1周組高于4周組、1周組高于8周組、4周組低于12周組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），ADC值在4周組最低，見圖3D和表1。

2.3 BCS模型大鼠HE及免疫組化結(jié)果

正常組及假手術(shù)組大鼠觀察至第12周，HE染色均無陽性表現(xiàn)，肝細(xì)胞規(guī)律排列，形態(tài)正常，肝血竇未見明顯擴(kuò)張（圖4A～B）。模型組大鼠肝臟病理損傷逐漸加重，1周組肝細(xì)胞規(guī)律排列，形態(tài)正常，肝血竇未見擴(kuò)張（圖4C）；4周組肝細(xì)胞呈玻璃樣變性，肝血竇輕度擴(kuò)張伴少量紅細(xì)胞淤積（圖4D）；8周組肝細(xì)胞玻璃樣變性加重，肝血竇擴(kuò)張伴較多紅細(xì)胞淤積（圖4E）；12周組肝細(xì)胞壞死，胞漿紅染，肝血竇明顯擴(kuò)張伴大量紅細(xì)胞淤積（圖4F）。

圖3 各組大鼠肝臟T1WI圖

表1 各組大鼠ADC值（×10-3 mm2/s）比較（各亞組n=9，±s）

表1 各組大鼠ADC值（×10-3 mm2/s）比較（各亞組n=9，±s）

注：與1周組比，*P＜0.05；與4周組比，＃P＜0.05；與8周組比，△P＜0.05；與12周組比，☆P＜0.05；正常組 vs 模型4周組、8周組，均P＜0.05；假手術(shù)組 vs 模型4周組、8周組，均P＜0.05。

時間 模型組 假手術(shù)組 正常組 F值 P值1周 1.23±0.08#△ 1.26±0.07 1.27±0.08 1.497 0.244 4周 1.03±0.09*☆ 1.28±0.05 1.27±0.08 34.199 0.001 8周 1.12±0.09* 1.28±0.06 1.27±0.08 10.079 0.001 12周 1.18±0.07# 1.27±0.08 1.27±0.08 4.045 0.031 F值 11.184 1.143 — — —P值 0.001 0.934 — — —

正常組（圖5A）、假手術(shù)組（圖5B）觀察至第12周，HIF-1α未見陽性染色，模型組第4周HIF-1α（圖5C）陽性染色最顯著，位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、匯管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞和膠原組織；正常組（圖5D）、假手術(shù)組（圖5E）觀察至第12周NF-κB未見陽性染色，模型組第4周NF-κB（圖5F）陽性染色最顯著，位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、匯管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞和膠原組織。

2.4 BCS模型大鼠HIF-1α檢測結(jié)果

組間比較，術(shù)后1、4、8、12周，同一時間點，三組之間HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)水平均存在統(tǒng)計學(xué)差異，兩兩比較發(fā)現(xiàn)正常組與假手術(shù)組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），模型組高于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

圖4 術(shù)后12周各組大鼠肝臟病理圖片（HE，×200）

組內(nèi)比較，隨著梗阻時間延長，模型組HIF-1α的mRNA及蛋白水平先升高后下降，BCS模型造模后4周最高，整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=877.911、333.136，P＜0.05），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。假手術(shù)組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。正常組只有一個時間點的數(shù)值，不做比較。詳見表2和圖6。

2.5 BCS模型大鼠NF-κB檢測結(jié)果

組間比較，術(shù)后1、4、8、12周，同一時間點，三組之間NF-κB的mRNA及蛋白表達(dá)水平均存在統(tǒng)計學(xué)差異，兩兩比較發(fā)現(xiàn)正常組與假手術(shù)組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），模型組高于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

組內(nèi)比較，隨著梗阻時間延長，模型組NF-κB的mRNA及蛋白水平先升高后下降，BCS模型造模后4周最高，整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=265.148、334.147，P＜0.05），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。假手術(shù)組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。正常組只有一個時間點的數(shù)值，不做比較。詳見表3和圖6。

2.6 各指標(biāo)間相關(guān)性分析

模型組ADC值與HIF-1α、NF-κB負(fù)相關(guān)；HIF-1α與NF-κB正相關(guān)；詳見圖7A～C和表4。

3 討論

BCS隨著肝靜脈回流受阻后淤血缺氧加重，可造成肝細(xì)胞水腫、肝微循環(huán)障礙、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外水分子和灌注的改變，可早于肝臟形態(tài)學(xué)改變被DWI檢測[5-6]。

圖5 各組大鼠免疫組化圖片（×200）

表2 三組大鼠HIF-1α mRNA及蛋白比較（各組n=9，±s）

表2 三組大鼠HIF-1α mRNA及蛋白比較（各組n=9，±s）

組別1周 4周 8周 12周 F（P）值mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常組 1.03±0.11 0.31±0.04 1.03±0.11 0.31±0.04 1.03±0.110.31±0.04 1.03±0.110.31±0.04 - -假手術(shù)組 1.05±0.10 0.31±0.03 1.04±0.08 0.30±0.02 1.01±0.090.28±0.04 1.02±0.110.31±0.03 1.022(0.309) 0.714(0.547)模型組 1.70±0.19 0.65±0.04 7.26±0.87 1.28±0.06 4.67±0.241.04±0.07 3.26±0.240.79±0.03 877.911(0.001)333.136(0.001)F值 119.816 253.294 1617.693 1379.092 632.139 1435.154 593.070 1085.194 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖6 各組HIF-1α、NF-κB蛋白表達(dá)圖

表3 三組大鼠NF-κB mRNA及蛋白比較（各組n=9，±s）

表3 三組大鼠NF-κB mRNA及蛋白比較（各組n=9，±s）

組別1周 4周 8周 12周 F（P）值mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常組 1.02±0.080.33±0.02 1.02±0.08 0.33±0.02 1.02±0.080.33±0.02 1.02±0.080.33±0.02 - -假手術(shù)組 1.01±0.09 0.35±0.04 0.99±0.12 0.36±0.08 1.02±0.100.32±0.06 0.98±0.090.34±0.07 0.482(0.697) 0.861(0.471)模型組 1.79±0.18 0.72±0.09 6.87±0.78 1.45±0.09 4.77±0.641.19±0.12 3.57±0.370.88±0.11 265.148(0.001)334.147(0.001)F值 467.294 158.382 548.342 810.293 576.327 682.753 664.178 187.423 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖7 各指標(biāo)相關(guān)性散點圖

表4 ADC值與HIF-1α、NF-κB相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)r）

HIF-1α是調(diào)節(jié)參與細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧期間高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟損傷[9-10]。NF-κB是與免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子B位點特異性結(jié)合的核蛋白因子，在各種類型的肝損傷及肝纖維化中發(fā)揮作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組HIF-1α、NF-κB水平均高于正常組及假手術(shù)組，且互為正相關(guān)，提示其可能相互調(diào)節(jié)并參與了BCS模型肝損傷的進(jìn)展。模型組HIF-1α、NF-κB先升后降，不同于其他原因肝病中隨肝損傷進(jìn)展持續(xù)上升的報道[10，12-13]，說明其誘導(dǎo)BCS肝損傷的機(jī)理有所不同，可能是肝臟淤血缺氧后上調(diào)HIF1α表達(dá)，激活其下游TGF-β1、PDGF-B等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟淤血缺氧損傷[12，14]；其后隨側(cè)支循環(huán)緩解淤血缺氧，從而下調(diào)HIF-1α、NF-κB的水平，但其始終高于正常，說明側(cè)支循環(huán)僅可部分緩解淤血缺氧，而無法從根本解決BCS淤血性肝損傷[15]。

本研究中，模型組ADC值低于正常組及假手術(shù)組，說明BCS肝組織存在水分子彌散受限，模型組的ADC值先下降后上升，與HIF-1α、NF-κB水平先上升后下降形成負(fù)相關(guān)，不同于其他原因肝病中隨肝損傷進(jìn)展持續(xù)下降的報道[16-17]，這可能是因為隨著IVC結(jié)扎時間延長，肝淤血缺氧加重，引發(fā)HIF1α持續(xù)高表達(dá)及氧自由基增加，激活NF-κB及TGF-β1等信號，導(dǎo)致其下游靶基因的激活和HSC的活化，抑制ECM降解[12-14]；另一方面，HV回流受阻，減弱水分子擴(kuò)散能力和微循環(huán)灌注，肝細(xì)胞線粒體腫脹[5]，改變細(xì)胞膜的流動性和通透性，降低ADC值[5，18]，故而與HIF-1α、NF-κB負(fù)相關(guān)，這與病理結(jié)果中肝細(xì)胞腫脹、肝竇淤血相符，提示ADC值可反映BCS肝淤血缺氧程度。模型組隨著側(cè)支循環(huán)建立，緩解淤血缺氧及氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)外水分子擴(kuò)散及微循環(huán)的代償性改善表現(xiàn)為ADC值升高以及HIF-1α、NF-κB下調(diào)[12-14]，這提示三者的變化與淤血缺氧密切相關(guān)。然而，ADC值雖有升高，仍低于正常，說明側(cè)支循環(huán)雖部分緩解了淤血，但肝臟病理損傷仍緩慢進(jìn)展，這與大量臨床報道相符[15，19]，說明只有介入開通梗阻靜脈才是治療BCS的根本手段。

值得注意的是，本研究還存在局限性：大鼠肝臟體積較小，呼吸運(yùn)動及肺底和腹腔氣體等均可能影響ADC值及病理取材的準(zhǔn)確性。大鼠生命周期有限，尚無法完美模擬人體長達(dá)數(shù)十年的BCS病程。

本研究建立大鼠BCS動物模型，動態(tài)檢測了ADC值、HIF-1α、NF-κB的變化，發(fā)現(xiàn)隨著IVC結(jié)扎時間延長，BCS肝臟ADC值與HIF-1α、NF-κB負(fù)相關(guān)，三者隨著側(cè)支循環(huán)緩解淤血缺氧，改善細(xì)胞水腫及微血管灌注而升高（下降），說明這幾個指標(biāo)與BCS的肝淤血缺氧損傷存在一定相關(guān)性，可作為無創(chuàng)評估BCS肝損傷的一個新的選擇。