花青素穩(wěn)定性影響因素及改善方法研究進(jìn)展

徐青，王代波，劉國華，李冰晶，周元敬

（1.貴州科學(xué)院生物研究所，貴州貴陽550009；2.貴州科學(xué)院分析測(cè)試研究院，貴州貴陽550000）

花青素（Anthocyanidin），又稱花色素，是自然界廣 泛存在的一種水溶性天然色素，最早是從紅葡萄渣中提取出來的葡萄皮紅，并于1879年在意大利上市。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在越橘、紫甘薯、黑醋栗、葡萄皮、紫茄果皮等中均含有豐富的花青素，其廣泛分布于27個(gè)科，72個(gè)屬的被子植物體的花、果實(shí)、種子和葉片中?；ㄇ嗨貙儆诜宇惢衔镏械念慄S酮類（flavonoids）化合物，具有抗氧化、抗癌癥、抗炎癥、抗衰老、抗肥胖、改善大腦功能、保護(hù)視力、保護(hù)心血管、保健皮膚和美容等方面的功效，在食品飲料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。然而，天然的花青素是不穩(wěn)定的，受本身結(jié)構(gòu)和外界環(huán)境的影響而變質(zhì)，對(duì)光照、溫度、pH值、金屬離子、氧化劑等因素敏感，使其的應(yīng)用范圍受到很大限制[5-6]。研究并提高花青素在加工和儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性，從而拓寬其應(yīng)用范圍具有非常重要的意義。本文綜述了花青素的穩(wěn)定性研究概況，并分別從物理和化學(xué)兩個(gè)角度重點(diǎn)探討了提高花青素穩(wěn)定性的處理方法和技術(shù)手段，以期為花青素的深入研究和產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 結(jié)構(gòu)和種類

花青素的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

由圖1可知，基本母核單元是2-苯基苯并吡喃，即花色基元（Flavylium）。絕大多數(shù)花青素在花色基元的3-，5-，7-位碳上有取代羥基，由于B環(huán)各碳位上所帶羥基數(shù)（-OH）、甲基化（methylation）、糖基化（glycosylation）數(shù)目、糖種類和連接位置的不同而呈現(xiàn)不同顏色。自然界已知的花青素有22大類，500多種，其中最為常見的6種花青素分別為：矢車菊素或芙蓉花色素（Cyanidin）、飛燕草素或花翠素、翠雀素（Delphinidin）、天竺葵素（Pelargonidin）、芍藥素（Peonidin）、牽牛素（Petunidin）和錦葵素（Malvidin），其具體結(jié)構(gòu)和顏色如表1所示。

表1 6種常見的花青素Table 1 Six common anthocyanidins

這6種花青素占了總量的90%以上，它們?cè)谧匀唤缰械姆植急壤謩e約為50%、12%、12%、12%、7%、7%。其中矢車菊素、飛燕草素和天竺葵素分布最為廣泛和普遍，80%的有色葉子、69%的果實(shí)和50%的花朵中都有存在[7]。

花青素一般以糖苷形式存在，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色苷（Anthocyanin）。糖苷可取代 3，5，7 位，其中 3-糖苷最為常見。

2 花青素穩(wěn)定性影響因素

花青素被公認(rèn)為最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一，是因?yàn)槠渚哂腥彪娮拥慕Y(jié)構(gòu)特征，極易受到活性氧負(fù)離子和自由電子的攻擊。正因如此，使花青素具有較大的不穩(wěn)定性且易發(fā)生降解作用。除了自身結(jié)構(gòu)外，外界pH值、溫度、光、金屬離子、輔色素、食品添加劑等環(huán)境因素也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性[8-9]。

2.1 結(jié)構(gòu)的影響

從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，花青素的母核單元缺少一個(gè)電子，其穩(wěn)定性主要受結(jié)構(gòu)中B環(huán)取代基的影響，羥基或甲基等供電子基團(tuán)的存在會(huì)降低其穩(wěn)定性，特別是在中性條件下最不穩(wěn)定，反之則穩(wěn)定性較好，因此天竺葵色素是最穩(wěn)定的花青素[10]。研究發(fā)現(xiàn)，95℃熱處理黑加侖提取液150 min，其中主要的4種花色苷熱穩(wěn)定順序?yàn)椋菏杠嚲账?3-蕓香糖苷＞花翠素-3-蕓香糖苷≈矢車菊素-3-葡萄糖苷＞花翠素-3-葡萄糖苷[11]。就糖基化而言，花色苷的穩(wěn)定性受糖基的類型、數(shù)量及結(jié)合位點(diǎn)的影響?；ㄇ嗨靥擒栈牧u基化會(huì)使花青素的穩(wěn)定性降低，而糖苷基的甲基化、糖基化、酰基化都會(huì)增加花青素的穩(wěn)定性；不同的糖基也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性，按照葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的順序依次降低[12]。

2.2 pH值的影響

在研究中發(fā)現(xiàn)，花青素作為一種水溶性色素，其顏色可隨細(xì)胞液的酸堿度而改變，細(xì)胞液呈酸性則偏紅，細(xì)胞液呈堿性則偏藍(lán)。該現(xiàn)象說明花青素的穩(wěn)定性受pH值影響較為明顯，這是因?yàn)榛ㄇ嗨氐娜彪娮有螒B(tài)在環(huán)境pH值發(fā)生變化時(shí)受電荷的影響，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也相應(yīng)發(fā)生變化。不同pH值下花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)和降解反應(yīng)見圖2。

如圖2所示，花青素隨pH值變化在黃鹽陽離子、醌型堿、假堿、查耳酮4種形式之間發(fā)生可逆改變。當(dāng)溶液的pH 1時(shí)，花青素主要以黃鹽陽離子形式存在，溶液顯紫色或紅色；當(dāng)pH值在2～4之間時(shí)，花青素失去C環(huán)氧上的陽離子變成藍(lán)色醌型堿。醌型堿在酸性溶液中與黃洋鹽陽離子間發(fā)生可逆轉(zhuǎn)化；當(dāng)pH值升高為5～6時(shí)，主要以假堿和查耳酮兩種形式存在且二者也可發(fā)生可逆轉(zhuǎn)化，溶液呈無色。即當(dāng)pH值在4～6之間時(shí)花青素的4種不同結(jié)構(gòu)形式共存，它們通過黃鹽陽離子在醌基和甲醇基之間建立平衡，當(dāng)pH值高于7時(shí)，花青素將被降解。因此，在強(qiáng)酸性條件下，花青素將以黃鹽陽離子這一相對(duì)穩(wěn)定的單一離子形式存在[13-14]。

圖2 不同pH值下花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)和降解反應(yīng)Fig.2 Chemical structure and degradation reaction of anthocyanidins at different pH

2.3 溫度的影響

研究表明，無論在天然狀態(tài)下還是實(shí)驗(yàn)室條件下，花青素的穩(wěn)定性都會(huì)受到溫度的影響。一方面，高溫會(huì)促使花青素糖苷的水解，從而失去保護(hù)而降解；另一方面，高溫會(huì)使花青素芘環(huán)水解產(chǎn)生白堊，這也是花青素受熱變成棕色的原因[15]。野生狀態(tài)下，25℃是藍(lán)莓花青素最為穩(wěn)定的一個(gè)溫度，當(dāng)溫度逐漸升高到60℃時(shí)，花青素就會(huì)以查爾酮式結(jié)構(gòu)存在，穩(wěn)定性變得非常差，顏色也轉(zhuǎn)為無色[16]。當(dāng)花色苷溶液加熱時(shí)，平衡向著無色查耳酮方向進(jìn)行，同時(shí)引起有色型化合物的降低。當(dāng)冷卻和酸化時(shí)醌型堿和假堿迅速變成陽離子，但是查耳酮的變化相當(dāng)慢，在25℃下3，5-二葡萄糖苷和3-葡萄糖苷的查耳酮型達(dá)到與其相應(yīng)的黃洋鹽陽離子的平衡分別需用12 h和6 h～7 h，而且溫度越低需時(shí)越長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，花青素的受熱降解為一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[17]。

2.4 光的影響

光對(duì)花青素的影響有兩個(gè)方面，一方面光照能夠促進(jìn)花青素的生物合成，另一方面光照能加速花青素本身發(fā)生降解[17-21]。謝程程的研究表明長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)誘導(dǎo)花青素碳骨架在C2位上斷開，形成C4羥基的降解中間產(chǎn)物，之后被氧化成查耳酮，而查耳酮進(jìn)一步被氧化為苯甲酸及2，4，6-三羥基苯甲醛等終水解產(chǎn)物，從而導(dǎo)致花色苷被降解，顏色消退[17]。Ochoa等研究表明光使花青素的降解也符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，在有光和避光條件下花青素的降解有顯著差異[20]。

2.5 金屬離子的影響

有研究表明，大多數(shù)金屬離子是保護(hù)花青素穩(wěn)定性的，展現(xiàn)出護(hù)色效果，不同顏色是因?yàn)榻饘匐x子與花青素黃洋鹽離子形成的螯合物的作用產(chǎn)生的。金屬離子的濃度以及護(hù)色對(duì)象不一樣，其護(hù)色的效果也不一樣。例如Ca2+、Cu2+、A13+等具有增色作用但其對(duì)花色苷的穩(wěn)定性并沒有顯著的影響，而高濃度的Zn2+、Mg2+不僅具有增色作用，而且能夠增加藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性。但并不是所有金屬離子都會(huì)提高花青素的穩(wěn)定性，如 Fe2+、Fe3+、Pb2+等對(duì)花青素具有破壞作用，使花青素的穩(wěn)定性下降；Fe3+、Sn2+可使紫甘薯花青素溶液顏色加深并生成沉淀[22-23]。

2.6 食品添加劑的影響

食品添加劑也會(huì)對(duì)花青素的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，且不同的食品添加劑影響程度也不一樣。徐馨等研究了不同添加劑對(duì)火龍果皮紅色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明：茶多酚、沒食子酸會(huì)破壞紅色素的顏色，而檸檬酸、山梨醇、苯甲酸鈉、抗壞血酸可一定程度上提高紅色素的穩(wěn)定性[24]。姚思敏薔等研究發(fā)現(xiàn)木糖醇和丁基羥基茴香醚會(huì)使黑果枸杞中花青素溶液褪色，0.1%抗壞血酸會(huì)增加花青素顏色的穩(wěn)定性，高濃度抗壞血酸起到反作用，沒食子酸丙酯對(duì)花青素穩(wěn)定性起保護(hù)作用，山梨酸鉀和雙氧水會(huì)破壞花青素類物質(zhì)[25]。

3 提高花青素穩(wěn)定性的方法

花青素的穩(wěn)定性較差，其降解變質(zhì)不僅發(fā)生在提取純化的制備過程中，而且存在于存儲(chǔ)、加工過程中。目前關(guān)于提高花青素穩(wěn)定性的方法研究報(bào)道較多，本文分別從物理和化學(xué)兩種方法進(jìn)行闡述。

3.1 物理方法

3.1.1 常規(guī)手段

由于花青素的穩(wěn)定性受pH值、溫度、光等的影響顯著，因此，在制備和儲(chǔ)存過程中，應(yīng)盡量保證pH值小于3、低溫（＜60℃）、避光保存[26]。研究表明，為了保證藍(lán)莓飲料中花色苷的穩(wěn)定性，應(yīng)以高溫短時(shí)滅菌（121℃，10 s）和存儲(chǔ)完整的標(biāo)簽包裝[27]。藍(lán)莓鮮果最好-18℃凍存；藍(lán)莓果汁最好4℃貯藏，且酸度盡量調(diào)低，如調(diào)到pH 2.1，這樣不僅可以保留更多的花青素，而且可以起到更好的抗氧化功效[11，28]。

3.1.2 添加輔色劑

輔色劑分子中通常含有豐富電子，這些電子與2-苯基苯并吡喃陽離子相互作用，避免水的親核攻擊，稱為輔色效應(yīng)，對(duì)花青素具有顯著的穩(wěn)定作用。輔色劑種類包括黃酮、生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸、多糖、金屬離子以及花青素本身[29]。研究發(fā)現(xiàn)，L-色氨酸通過氫鍵和疏水相互作用可使含抗壞血酸體系中花青素的半衰期延長(zhǎng)3.91 d[30]。在酚類和花青素共色作用中，電離電位是影響共色效果的決定性因素，電離電位越負(fù)，給電子能力越強(qiáng)，穩(wěn)定效果越好[31]，Cruz等還認(rèn)為酚類提升穩(wěn)定性的效果與其分子立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，共平面的酚類如槲皮素、蘆丁等的共色效果優(yōu)于不共平面的酚類如兒茶素、表兒茶素等[32]?；ㄇ嗨乇旧韺儆诙喾宇愇镔|(zhì)，可通過芳香母核之間的疏水相互作用，形成垂直堆疊的分子復(fù)合物，使其穩(wěn)定性增強(qiáng)，然而這種自締合作用受濃度、溶液pH值、溫度及溶劑等因素的影響比較明顯[33-34]。

3.1.3 與有機(jī)大分子復(fù)合

花青素可通過氫鍵、靜電效應(yīng)和疏水效應(yīng)等相互作用分別與蛋白質(zhì)、環(huán)糊精、多糖等有機(jī)大分子形成復(fù)合物，從而提高其熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。研究表明，矢車菊色素-3-葡萄糖苷和牛血清白蛋白之間的復(fù)合，氫鍵是主要結(jié)合力[35]，復(fù)合后的矢車菊素-3-葡萄糖苷對(duì)光、熱以及強(qiáng)氧化還原劑的穩(wěn)定性顯著提高，且具有更好的自由基清除能力和對(duì)鐵的還原能力[36]。Wu研究發(fā)現(xiàn)甘露糖蛋白能與花青素通過疏水相互作用形成復(fù)合物，將花青素的熱穩(wěn)定性（pH 7.0，80℃或126℃熱處理30 min）提高4倍～5倍[37]。

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）利用“外壁親水、內(nèi)腔疏水”的圓臺(tái)形結(jié)構(gòu)與花青素分子形成環(huán)糊精-花青素包結(jié)物，但其提高花青素穩(wěn)定性的效果與環(huán)糊精和花青素的種類、溶液pH值等都有關(guān)[38]。Howard等的研究認(rèn)為pH 3.6及3%的β-CD添加量對(duì)野櫻莓花青素貯藏穩(wěn)定性的提升效果最好[39]。Fernandes等的研究表明β-CD對(duì)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷溶液顏色具有減褪作用，且這種作用隨pH值增加變得越明顯；而α-CD對(duì)它的溶液顏色卻無顯著影響[40-42]。

多糖與花青素的復(fù)合，根據(jù)分子種類、溶液pH值等因素的不同，對(duì)花青素穩(wěn)定性可產(chǎn)生促進(jìn)、降低和無影響3種情況[43]。如花青素通過與阿拉伯膠上的糖蛋白發(fā)生氫鍵作用形成復(fù)合物，從而可抑制飲料中抗壞血酸對(duì)紫胡蘿卜花青素的降解[44]。Guan等通過疏水相互作用形成納米尺度的復(fù)合物，可使pH 5.0的花青素溶液在80℃和126℃的熱穩(wěn)定性分別提高2倍和1.8倍[45]。陰離子型多糖卡拉膠能與花青素通過靜電相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物[46]。

3.1.4 膠囊包埋

近年來，膠囊包埋在對(duì)食品活性成分的穩(wěn)定化及生物利用度提升方面表現(xiàn)出巨大的潛力[47-48]。目前用于制備花青素膠囊的方法，主要包括離子交聯(lián)法、乳化-熱膠凝法、噴霧干燥以及冷凍干燥法等，包埋的體系主要有3類：微膠囊、脂質(zhì)體（Liposomes）和聚合物納米顆粒（Polymer nanoparticles）[49]。Ko等用芥子酸對(duì)黑大豆花青素進(jìn)行輔色，采用離子凝膠法制備納米膠囊后，花青素的顏色更穩(wěn)定，抗氧化活性更有效[50]。He等用殼聚糖納米顆粒包埋藍(lán)莓花青素，納米顆粒平均粒徑219 nm，包埋的花青素在模擬胃腸液中降解緩慢，在模擬飲料中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性也明顯提升[51]。

3.1.5 其他手段

韓成云研究發(fā)現(xiàn)，不同提取方法對(duì)紫薯花青素的穩(wěn)定性影響不同，微波法提取的紫薯花青素?zé)岱€(wěn)定性效果最佳，超聲波法提取的紫薯花青素對(duì)pH值穩(wěn)定性最佳[52]。Rabelo等將Acai漿果提取物制備成一種水包油的納米乳液，可以顯著提高花青素的保存率[53]。植物組織培養(yǎng)不僅可以提高花青素產(chǎn)量，還是增強(qiáng)花青素穩(wěn)定性的有效途徑。

3.2 化學(xué)方法

花青素通過化學(xué)方法進(jìn)行修飾，往往具有更高的穩(wěn)定性。這是因?yàn)榛ㄉ罩械奶擒栈膳c一個(gè)或多個(gè)分子的有機(jī)酸，主要有咖啡酸、阿魏酸、安息香酸、肉桂酸、丙二酸、葡萄糖酸等，通過酯鍵形成酰基化的花色苷[54-56]。?；捎行У刈璧K花青素4種化學(xué)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，?；饔玫挠袡C(jī)芳香酸或脂肪酸對(duì)花青素的穩(wěn)定起到了很大的作用?；ㄉ罩辛鲃?dòng)的糖鏈就像一條帶子將折疊好的?；p繞在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，這種堆積作用不僅對(duì)花青素具有保護(hù)作用，而且對(duì)系統(tǒng)的色澤穩(wěn)定性具有積極的作用，稱為花青素的“三明治”結(jié)構(gòu)[57]。酰基平面碳鏈殘基和花青素核之間疏水作用力形成層狀結(jié)構(gòu)，較好地保護(hù)了夾在兩個(gè)有機(jī)酸中間的花青素核，使其能夠較好地抵抗親水攻擊和其它類型的降解反應(yīng)[58]。

對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行了一系列脂肪酸酰化修飾，對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行酰化前后的不同溫度穩(wěn)定性研究結(jié)果見圖3。

圖3 藍(lán)莓花青素酰化前后溫度穩(wěn)定性Fig.3 Temperature stability before and after acylation of blueberry anthocyanins

由圖3可知，藍(lán)莓花青素被?；螅瑩碛懈叩臒崮褪苄?，特別是加熱4 h后是很顯著的。在80℃～100℃下，加熱10 h，?；乃{(lán)莓花青素保留率高達(dá)50.18%，而未被?；乃{(lán)莓花青素保留率僅為22.27%[59]。

圖4是對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行?；昂蠊夥€(wěn)定性研究結(jié)果。

由圖4可知，藍(lán)莓花青素被酰化后，擁有更高的光穩(wěn)定性，光照10 d后?；乃{(lán)莓花青素保存率在65%以上，而未被酰化的藍(lán)莓花青素保存率僅為60%。避光保存，對(duì)藍(lán)莓花青素和?；幕ㄇ嗨囟际亲詈玫膬?chǔ)存方法[60]。

圖4 藍(lán)莓花青素?；昂蠊夥€(wěn)定性Fig.4 Light stability before and after acylation of blueberry anthocyanin

花青素骨架和糖基上都帶有自由的羥基，羥基使得花青素不穩(wěn)定，羥基被?；螅梢蕴岣呋ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性。研究表明，?；乃{(lán)莓花青素對(duì)光和熱的穩(wěn)定性，是隨著脂肪酸碳鏈的增長(zhǎng)而增加，當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)到8以后，穩(wěn)定性變化不顯著；當(dāng)脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度一樣時(shí)，多元酸比一元酸更穩(wěn)定。

4 展望

隨著人們生活水平的日益提高，人們?cè)絹碓街匾暯】岛突貧w自然，越來越青睞天然食品，大力開發(fā)利用天然花青素等植物色素以及提高其穩(wěn)定性已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。依據(jù)花青素的結(jié)構(gòu)和特性，通過不同的技術(shù)手段來提高花青素的穩(wěn)定性，使其具有更廣闊的應(yīng)用前景是將來發(fā)展的必由之路。