RP-HPLC法分析測定人參、西洋參、三七中的皂苷類化合物

王晶，張勇，畢萌菲，李福森，劉春明

（長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

五加科人參屬中重要的3種植物人參、西洋參、三 七均為名貴中藥材，現(xiàn)代藥物化學研究表明，三者中主要的有效成分均為皂苷類化合物，迄今為止，從人參中分離得到近百種皂苷單體化合物[1-3]，從西洋參和三七中也分離得到了數(shù)十種人參皂苷[4-6]。3種中藥有效成分中含有多個相同的單體皂苷類化合物，但也有其特征的皂苷成分，例如擬人參皂苷F11為西洋參特征性成分，三七皂苷R1為三七特征成分[7]?，F(xiàn)代藥理作用研究表明，人參皂苷類化合物具有廣泛的藥理活性，如延緩衰老、提高免疫力、抗腫瘤、益智、抗氧化、抗高血壓、抗高血糖以及防治阿爾茲海默癥等作用[8-10]，廣泛應用于食品、藥品、保健品及化妝品等領域。

人參于2012年被審批為新資源食品后，在食品工業(yè)中發(fā)展迅速，近年來出現(xiàn)大量與人參相關的各種食品；而西洋參因為被廣泛認為“溫補”的特性，在保健品市場中常有銷售；而被稱為“銅皮鐵骨”的三七近年來更是備受矚目中藥藥效研究發(fā)現(xiàn)有效成分決定了其藥理活性，而人參、西洋參和三七作為同科同屬的植物，較多的成分是比較相似的，而作為其中最重要組分的皂苷類成分，諸多的學者進行大量的研究。本研究選購市售人參根部切片、西洋參根部切片和三七根部藥材，以其中主要皂苷類化合物為研究對象，考察3種不同的提取方法（回流、超聲輔助、溫浸）對皂苷類化合物的提取效果，應用高效液相色譜（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）分析3種藥材中8種主要單體皂苷含量，考察市售人參、西洋參和三七藥材中主要成分（皂苷類化合物）在不同藥材中的分布情況以及主要皂苷含量差異。

1 試驗部分

1.1 藥品與儀器

1.1.1 試劑與材料

液相色譜所用試劑（乙腈為色譜純）：加拿大Caledon LaboratoriesL公司；超純水：長春師范大學中心實驗室自制；0.45 μm濾膜：美國Agilent公司；乙醇、甲醇（均為分析純）：北京精細化學品有限公司。人參切片、西洋參切片、三七根部藥材：同仁堂大藥房；人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、三七皂苷 R1對照品：中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 儀器設備

高效液相色譜為Agilent 1100（配備四元梯度泵、自動在線脫氣機）、Agilent1200系列柱溫箱，色譜柱型號為 Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用 DAD檢測器：美國安捷倫有限公司；Advantage A10密理博超純水凈化系統(tǒng)：法國密理博科技有限公司；Hei-VAP旋轉蒸發(fā)儀：中國上海EYELA公司；BS-124S電子天平：德國賽多利斯有限公司；S180H超聲清洗器：德國Elma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

將人參、西洋參、三七藥材粉碎，過80目篩，采用不同提取方法進行樣品制備。

超聲輔助提取法：分別精密稱取人參粉末1.0008g、西洋參粉末1.000 7 g和三七粉末1.000 4 g置于100 mL具塞錐形瓶中，用30 mL 95%乙醇浸泡30 min，超聲輔助提取30 min，重復上述提取過程3次。將乙醇提取液合并后過濾，減壓回收溶劑至干，色譜甲醇溶解殘渣，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，得到人參、西洋參、三七樣品超聲輔助提取物（主要為皂苷類化合物），4℃保存，待用。

分別精密稱取人參粉末1.000 6 g、西洋參粉末1.000 8 g、三七粉末1.000 9 g置于100 mL具塞錐形瓶中，90 mL 95%乙醇浸泡 30 min，70℃回流提取120 min。將乙醇提取液過濾，減壓回收溶劑至干，色譜甲醇溶解殘渣，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，得到人參、西洋參、三七回流提取物溶液，4℃保存，待用。

分別精密稱取人參粉末1.000 8 g、西洋參粉末1.000 3 g、三七粉末1.000 1 g，30 mL 95%乙醇浸泡30 min后60℃水浴溫浸提取60 min，提取3次。合并乙醇提取液，過濾，濾液減壓回收至干，色譜甲醇溶解殘渣，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，得到人參、西洋參、三七樣品溫浸提取物，4℃保存，待用。

1.2.2 皂苷標準溶液配制

分別精密稱取三七皂苷R1標準品、人參皂苷標準品 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd 各 1.00 mg，色譜純甲醇溶解，得到濃度為約1 000 μg/mL的儲備液，-20℃的冰箱保存，待用。

1.3 HPLC分析條件

高效液相色譜分析條件如下：流動相組成為乙腈（A），0.05%的磷酸水溶液（B），流動相梯度：0～2 min，75%B；2 min～50 min，75%～50%B，流速為 0.5 mL/min。樣品總運行時間為50 min，柱溫選擇35℃，樣品進樣量為 10 μL。

2 結果分析與討論

2.1 標準曲線的繪制

由于不同皂苷單體在相同的濃度下出峰的情況有所差異，因此在配制皂苷混合標準品樣品時，皂苷單體的濃度各不相同，根據(jù)前期試驗結果，分別移取人參皂苷 Rb10.20 mL，三七皂苷 R1、人參皂苷 Re、Rg1、Rb2、Rd各0.10 mL，人參皂苷Rf和Rc各0.05 mL，配制皂苷混合標準品溶液。應用HPLC對皂苷標準品混合溶液進行分析，其中人參皂苷Re+Rg1合并出峰，其他各皂苷均得到較好的分離。以各皂苷的色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到不同皂苷的回歸方程，分別為人參皂苷Rd方程為y=556.6x+5.2169，回歸系數(shù)r為1；人參皂苷Rc方程為y=460.47x+25.155，回歸系數(shù)r為0.999 9；三七皂苷R1標準曲線方程為y=314.57x+134.66，回歸系數(shù)r為0.9998；人參皂苷Rb1方程為y=479.74x+25.155，回歸系數(shù)r為0.999 8；人參皂苷Rb2方程為y=592.31x-6.623 3，回歸系數(shù)r為0.999 8；人參皂苷Re+Rg1（合并出峰）方程為y=457.08x+303.81，回歸系數(shù)r為0.993 9；人參皂苷Rf方程為y=313.62x+7.227 2，回歸系數(shù)r為0.999 4。

2.2 HPLC分析的方法學考察

2.2.1 精密度

按1.3HPLC分析條件，對皂苷混合標準品重復測定5次，分別記錄8種皂苷（Rg1和Re合并出峰）色譜峰峰面積和保留時間，計算二者的標準偏差，結果表明7個色譜峰峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為0.21%、0.40%、0.25%、0.24%、0.28%、0.36%、0.29%和0.34%，而保留時間RSD值在0.11%～0.37%范圍之內，表明儀器方法的精密度較好。

2.2.2 穩(wěn)定性

按1.3中HPLC分析條件檢測人參超聲輔助提取物（人參提取物中含有皂苷種類較多，具有代表性），分別于制備樣品后的 0、2、6、10、16、24 h 進行 HPLC 分析。結果表明各主要皂苷的色譜峰面積的RSD值均小于1.34%，樣品穩(wěn)定性在24 h內較好。

2.2.3 重現(xiàn)性

取人參藥材粉末按1.2.1超聲輔助提取方制備5份供試液，應用HPLC進行分析。結果表明，各主要皂苷峰面積的RSD均小于1.21%，儀器方法重現(xiàn)性較好。

2.2.4 回收率

取人參藥材粉末按1.2.1超聲輔助提取方制備3份供試液，分別加入適量的7種人參皂苷（人參中不含有三七皂苷R1，因此沒有在人參提取物中添加三七皂苷R1），應用HPLC檢測加樣回收率。結果表明，主要皂苷的平均加樣回收率分別為100.22%、98.35%、97.20%、99.39%、100.27%和98.28%，RSD值在0.19%～0.45%范圍內，說明人參皂苷加標回收率良好。

三七、西洋參、人參超聲輔助提取物及皂苷標準品HPLC指紋圖見圖1，皂苷結構見圖2，圖2中不同皂苷的結構式中R1、R2、R3代表的基團見表1。

圖1 人參、西洋參、三七提取物及皂苷標準品HPLC圖（λ=203 nm）Fig.1 HPLC of ginseng，Panax quinquefolium，Panax notoginseng extracts and mixture standard saponins（λ=203 nm）

圖2 主要皂苷結構圖Fig.2 Structure of main saponins

2.3 不同提取方法的比較

人參皂苷的提取方法較多[11-14]，本文以五加科人參屬具有代表性的3種植物人參、西洋參和三七為研究對象，主要采用超聲輔助、回流和溫浸法對其中的皂苷類化合物進行提取，通過反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）方法分析3種藥材中的主要單體皂苷的含量，結果如表2所示。

從表2數(shù)據(jù)可知，不同方法對3種藥材中所提取的主要皂苷種類基本沒有影響，但對其含量影響較大。結果表明，3種藥材的超聲輔助提取物中主要皂苷的含量較高，回流提取物次之，溫浸提取物皂苷含量相對較低。相對于回流提取，超聲輔助提取物中雜質較少，更便于過濾以及后續(xù)的分析檢測，且超聲輔助提取效率較高、方法便捷。

表2 不同提取物中主要皂苷的含量（n=3）Table 2 Contents of main saponins in different extracts（n=3）mg/g

2.4 3種藥材中的主要皂苷含量比較

3種藥材超聲輔助提取物中主要皂苷情況見圖3。

圖3 3種藥材超聲輔助提取物中主要皂苷情況Fig.3 The main saponins of the different ultrasonic extracts

從表2和圖3的數(shù)據(jù)可以看出，在3種五加科人參屬代表藥材中，人參提取物中含有的主要皂苷種類較多，但對于相同質量的人參、西洋參和三七藥材來說，人參提取物中三者共有的主要皂苷含量相對較低；西洋參提取物中未檢測到人參皂苷Rf，但其他人參皂苷含量均高于人參提取物，其中，Re、Rg1、Rb1和Rd含量遠高于同質量的人參提取物；三七皂苷R1為三七的特有成分，在三七提取物中含量較高；三七提取物中未檢測到人參皂苷Rf、Rc和Rb2，其他主要人參皂苷單體的含量均遠高于同質量的人參和西洋參提取物。根據(jù)文獻報導，在人參的各部位中，參須中皂苷的含量相對較高，而在主根中其多分布于周皮與皮層中，相對的人參肉質髓心的皂苷含量較低[15]，由于所購買的人參切片中沒有參須部位，可能導致了其人參皂苷含量較低。有研究對人參、西洋參和三七藥材中總皂苷含量進行比較，發(fā)現(xiàn)三七提取物中總皂苷含量較高，其次是西洋參提取物[16]。由于所購買的藥材為人參、西洋參的切片和三七的根部，因此，三七中主要皂苷的含量較高，而西洋參提取物中皂苷含量次之，人參切片提取物中主要皂苷含量相對較低，但符合藥典規(guī)定標準，2015版藥典規(guī)定人參中Rg1和Re的總量不低于0.3%，Rb1的含量不低于0.2%。

3 結論

以五加科人參屬代表藥材人參、西洋參和三七中皂苷類化合物對研究對象，采用超聲輔助、回流和溫浸法進行提取，應用RP-HPLC方法對不同提取物中8種主要皂苷（其中Rg1和Re合并出峰）進行定量分析。結果表明，對比三種不同的提取方法，均為超聲輔助法對3種藥材中皂苷類化合物提取效果較好，且超聲輔助提取效率較高，提取物中雜質較少。對比3種藥材中主要皂苷的分布，人參中皂苷種類較多，只有三七皂苷R1（三七特有成分）未檢測到，而西洋參提取物中未檢測到人參皂苷Rf和三七皂苷R1，三七提取物中未檢測到人參皂苷Rf、Rc和Rb2；對比不同提取物中主要皂苷含量，在3種藥材的共有皂苷中，三七根部藥材中主要皂苷含量較高，西洋參次之，人參切片藥材中的皂苷含量相對較低，但符合藥典規(guī)定。