桑葚風(fēng)味構(gòu)成特點研究

張欣欣，周哲，陳炎，柴多，董亮，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116034）

桑葚，是?？粕俣嗄晟颈局参锷涞墓麑崳瑱E圓形，長1 cm～3 cm，表面不平滑。桑葚中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素A原、氨基酸、礦物質(zhì)鈣等營養(yǎng)成分[1]，而且含有多種功能性成分，具有良好的防癌、抗衰老、抗病毒等作用。Kim SY等[2]研究發(fā)現(xiàn)，服用桑葉茶具有降低血糖的功效。此外，桑葚紅色素是極好的天然花青類色素，具有很高的著色性以及穩(wěn)定性，對人體無害[3-4]。目前大多數(shù)科研學(xué)者對于桑葚的研究主要集中在桑葚的營養(yǎng)成分、藥理作用以及花青素等，對風(fēng)味的研究非常少。由于桑葚營養(yǎng)價值高，具有很高的食用、藥用價值，目前許多加工工廠也開發(fā)一些桑葚制品，并且相關(guān)產(chǎn)品以其獨特的風(fēng)味深受廣大消費者的喜愛。

本文利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成并確定了其香味活性物質(zhì)，為深入了解桑葚及其相關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)味構(gòu)成特點，拓展相關(guān)產(chǎn)品的品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無沙黑桑葚干：產(chǎn)自新疆吐魯番。

氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)品烷烴（C4-C20）：美國Sigma公司；2-甲基丁醛、正戊醛、異戊醛、正庚醛、正癸醛、正壬醛、糠醛、1-辛烯-3-醇、異戊醇、異辛醇、異戊酸、2，3-丁二醇、乙酸、2-甲基丁酸、己酸、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酮、苯甲酸甲酯、2-苯乙醇、3-羥基2-丁酮、乙酸乙酯、乙酸戊酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、己酸甲酯、己酸乙酯等標(biāo)準(zhǔn)化合物：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷（分析純）：大連博諾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MPS2固相微萃取自動進(jìn)樣器：德國Gerstel公司；DVB-CAR-PDMS（涂層厚度 50/30、65、75、100μm）萃取頭：美國Supelco公司；Agilent 6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司；FA1004型分析天平：上海精天科貿(mào)有限公司；SZF-06A索氏提取器：上海新嘉電子有限公司；2010+Plus島津氣相色譜：島津集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）預(yù)處理

精確稱取3.0 g經(jīng)液氮冷凍后磨成粉末的桑葚粉于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入1 mL 20%的NaCl，使其與桑葚粉末混合均勻，并用硅橡膠墊密封，在40℃恒溫水浴鍋中平衡30 min，使用4種不同固相微萃取纖維頭 （50/30 μm DVB/CAR/PDMS，65 μm PDMS/DVB，75 μm CAR/PDMS and 100 μm PDMS）采樣吸附，來優(yōu)化評估。同時對不同飽和時間（15、30、45 min）和萃取時間（30、45、60、75 min）進(jìn)行優(yōu)化，每個試驗重復(fù) 3 次平行，確定優(yōu)化條件。

1.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)的檢測分析

1）色譜條件：Agilent 6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，HP-5MS（30 m × 0.25 mm i.d.，0.25 μm）色譜柱；氦氣為載氣，不分流模式，流速：1 mL/min；程序升溫：初始溫度40℃，保留5 min，以3℃/min的速率升至50℃，保留3 min，再以5℃/min的速率升至150℃，最后以20℃/min升至250℃，保留5 min。進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器250℃；MSD溫度250℃。EI電離源，電子能量70 ev；離子源溫度230℃；掃描范圍29 amu～400 amu。四極桿溫度150℃[5]。

2）對質(zhì)譜圖用計算機(jī)Nist 08譜庫檢索，結(jié)合軟件進(jìn)行人工解析、色譜保留指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化合物比對鑒定。

1.3.3 桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量分析

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1.1中的標(biāo)準(zhǔn)品配制于二氯甲烷中，每毫升二氯甲烷中含有1 μL標(biāo)品，混合均勻。

1.3.3.2 樣品預(yù)處理

精確稱取3 g桑葚粉末，用濾紙包好放置于索氏提取器中，在圓底燒瓶中加入二氯甲烷，60℃水浴回流提取10 h，提取液50℃水浴蒸出有機(jī)溶劑，剩余部分氮吹濃縮至1 mL，將濃縮液密封保存待進(jìn)入氣相色譜進(jìn)行定量分析用[6]。

1.3.3.3 桑葚?fù)]發(fā)性嗅感物質(zhì)定量檢測

1）色譜條件：島津 2010氣相色譜儀，ATX-5（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm）色譜柱；載氣為高純氮氣，流速1 mL/min，氫離子化火焰檢測器，手動進(jìn)樣方式。

2）化合物濃度（μg/g）=該化合物所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度×該化合物峰面積/該化合物所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積

1.3.3.4 氣味活度值

氣味活度值（oder activity value，OAV）=揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的濃度/香氣閾值

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取頭類型對萃取效果的影響

用不同類型萃取頭對桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析檢測，揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 4種不同萃取頭測定桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms in the analysis of four different fibers

由圖 1 可知 ，PDMS/DVB、CAR/PDMS 和 DVB/CAR/PDMS 3種萃取頭出峰的數(shù)目要比PDMS多，CAR/PDMS萃取頭在后階段中檢出的風(fēng)味物質(zhì)較少，而萃取頭DVB/PDMS檢測出的大多數(shù)化合物的峰面積相對于DVB/CAR/PDMS萃取頭較小。同時，這種萃取頭萃取出的揮發(fā)性物質(zhì)更多，范圍更大，峰強(qiáng)度更高，更適于成分復(fù)雜的揮發(fā)物的鑒定，吸附靈敏度更高[7]。因此，選擇 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 為本試驗的最佳萃取頭類型。

2.1.2 飽和時間對萃取效果的影響

不同飽和時間對嗅感物質(zhì)的萃取效果如圖2。

圖2 不同飽和時間對嗅感物質(zhì)萃取效果的影響Fig.2 Effects of different saturation time on extraction efficiency of olfactory substances

由圖2可知，飽和時間對桑葚中揮發(fā)性化合物的影響較大，大部分風(fēng)味物質(zhì)的峰面積隨時間的增加而增加。其中，除苯乙烯、丙二醇甲醚醋酸酯和丁酸丁酯外其他物質(zhì)的峰面積均隨著飽和時間的升高而增大。因此，綜合考慮不同揮發(fā)性物質(zhì)在不同時間的峰面積及穩(wěn)定性變化，選擇飽和時間30 min作為最優(yōu)條件。

2.1.3 萃取時間對萃取效果的影響

不同萃取時間對桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取效果如圖3。

從圖3可知，部分風(fēng)味物質(zhì)隨萃取時間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，但總體上在萃取時間為60min時絕大部分揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積達(dá)到最大值，在75 min時其峰面積略有降低[8]，表明較長的萃取時間不一定得到最好的萃取效果[9-10]。另外，部分化合物的峰面積隨萃取時間的延長變化不明顯。研究發(fā)現(xiàn)：揮發(fā)性組分的分配系數(shù)、物質(zhì)的擴(kuò)散速率、樣品體積等因素決定了萃取過程的變化[11]。在此試驗中萃取時間為60 min時，萃取效果最佳，故選擇60 min為最佳萃取時間。

綜上，固相微萃取的最優(yōu)的試驗方案為：使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在40℃下飽和30 min，萃取60 min。

圖3 不同萃取時間測定桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果圖Fig.3 Effect of mulberry volatile flavor compounds extraction efficiency by different extraction time

2.2 桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析結(jié)果

利用優(yōu)化好的條件，分析桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)其氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectromety，GC-MS）總離子流圖如圖4，經(jīng)分析鑒定所得到的桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)見表1。

圖4 桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatogram in the analysis of volatile of mulberry by GC-MS

表1 桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析結(jié)果表Table 1 Analysis of volatile compounds from mulberry

續(xù)表1 桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析結(jié)果表Continue table 1 Analysis of volatile compounds from mulberry

由表1可知，醛類化合物是構(gòu)成桑葚?fù)]發(fā)性化合物的主要物質(zhì)，在桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)：多不飽和脂肪酸氧化形成醛類物質(zhì)，醛類對食品風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，是風(fēng)味重要來源[12]，其中2-甲基丁醛具有濃郁的麥香。研究發(fā)現(xiàn)具有青草味的己醛來自脂質(zhì)的氧化和微生物的氨基酸的分解代謝[13-14]。魏好程等[15]研究發(fā)現(xiàn)具有杏仁味的苯甲醛也是桃果實的主要呈香物質(zhì)之一。

芳香族化合物和酯類物質(zhì)檢測出的數(shù)量較醛類物質(zhì)少，但也對桑葚的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，是僅次于醛類物質(zhì)的揮發(fā)性化合物。在桑葚中共檢測出6種芳香族化合物。其中苯甲醛具有杏仁和甜的味道，它是由苯丙氨酸經(jīng)斯特雷克降解形成的[16]。酯類物質(zhì)也有6種。

檢測出4種醇類物質(zhì)，醇類物質(zhì)是脂肪酸氧化的產(chǎn)物[17]，一般醇類揮發(fā)物具有較高的閾值，其中戊醇具有花香和樹脂的味道，而亞油酸降解產(chǎn)物1-辛烯-3-醇具有蘑菇、蔬菜的氣味[18]，是桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成中較為重要的一種醇類物質(zhì)。

此外，還檢測到4種酸類物質(zhì)，而有機(jī)酸為水果中必不可少的成分之一，并對桑葚的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)[19]。

2.3 桑葚風(fēng)味化合物定量及香氣活性物質(zhì)的確定結(jié)果

2.3.1 定量分析結(jié)果

通過對桑葚中28種揮發(fā)性嗅感物質(zhì)進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表2。

表2 桑葚?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量分析及氣味活度值（OAV）Table 2 Quantitative analysis of volatile flavor substances and odor activity of mulberry

由表2可知，在桑葚中丁酸乙酯的含量最高（263 056.30 μg/g），其次是正己醛（178 872.50 μg/g）和乙酸（86 142.69 μg/g）。而己酸乙酯和異辛醇在的含量最小，分別為 131.10 μg/g 和 133.41 μg/g。從揮發(fā)性化合物的總含量來看，酯類化合物是桑葚制品中最主要的嗅感物質(zhì)，己酸乙酯和己酸甲酯相對較低，但也分別達(dá)到了131.10 μg/g和1 052.65 μg/g。在所有醛類物質(zhì)中，正己醛（178 872.50 μg/g）是含量最高的嗅感物質(zhì)，據(jù)報道它是由脂類的β氧化產(chǎn)生的[20]，其次是正庚醛（2 985.32 μg/g）。芳香族化合物中苯甲酸甲酯含量最高，有機(jī)酸類乙酸含量最高，醇類含量相對偏低，含量最高的是292.86 μg/g的1-辛烯-3-醇。

2.3.2 香味活性物質(zhì)分析結(jié)果

從表2中可知，桑葚制品中有17種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣味活度值（OAV）大于其本身化合物的閾值，即OAV≥1，包括醛類6種，酯類4種，酸類3種，芳香族2種和醇類2種，在所有嗅感物質(zhì)中異戊醛的氣味活度值最高（10588008）。因此，這17種揮發(fā)性化合物被確定為桑葚中的香味活性物質(zhì)，而異辛醇、糠醛、苯甲醛、己酸的OAV均小于1，說明其對桑葚的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。

上述結(jié)果表明，醛類和酯類化合物對桑葚制品的風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)，在桑葚風(fēng)味中起主要作用，OAV值相對來說也比較高，研究發(fā)現(xiàn)醛類和酯類化合物也是其他品種水果中主要的風(fēng)味物質(zhì)，對水果的香氣貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對桑葚?fù)]發(fā)性物質(zhì)的測定方法，并分析鑒定了其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的構(gòu)成及特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：萃取類型為50/30 μm DVB/CAR/PDMS，飽和時間30 min，萃取時間60 min為最佳分析條件；在此條件下共分析鑒定出28種揮發(fā)性化合物，包括醛類8種，芳香族化合物6種，酯類6種，醇類4種和酸類4種；其中17種揮發(fā)物被確認(rèn)為桑葚的香氣活性物質(zhì)，而異辛醇、糠醛、苯甲醛和己酸的OAV＜1，對桑葚風(fēng)味貢獻(xiàn)度較小。