中蜂與意蜂荔枝蜜揮發(fā)性成分的測(cè)定與對(duì)比分析

王桃紅，崔宗巖，張少博，賈光群，魏紅躍，李學(xué)民，張進(jìn)杰，魏玉海，王向紅

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北秦皇島066004；3.西寧海關(guān)技術(shù)中心，青海西寧810001）

荔枝蜜是以荔枝為蜜源植物釀造而成的，多產(chǎn)自我國(guó)華南地區(qū)[1]，如廣東、廣西、福建等省份。荔枝蜜呈淡琥珀色，質(zhì)地濃稠，微酸，有微結(jié)晶現(xiàn)象，具有荔枝清香氣味[2-3]。荔枝蜜因蜂種的不同可分為中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜。蜂蜜的香氣主要與其揮發(fā)性組分有關(guān)[4-6]，主要類(lèi)別是萜烯及其衍生物和苯的衍生物[5，7-9]等。已有研究對(duì)我國(guó)洋槐蜜[10-15]、油菜蜜[10，12，14，16-19]、荊條蜜[10-11，13]、棗花蜜[11，13，20-21]、椴樹(shù)蜜[10-12，14]等主要蜜種揮發(fā)性成分進(jìn)行了報(bào)道。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)荔枝蜜揮發(fā)性成分的報(bào)道較少，龍銀花等[22]采用循環(huán)氣提-樹(shù)脂吸附法采集荔枝蜜的香氣物質(zhì)，共鑒定出14種化合物；Praetinee Pattamayutanon等[5]利用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（headspace solid phase microextraction，HS-SPMEGC-MS）技術(shù)分析泰國(guó)荔枝蜜中的揮發(fā)性有機(jī)化合物，共檢測(cè)出30種揮發(fā)性物質(zhì)，其中芳樟醇氧化物為含量最高的成分。

本文研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC/MS）分別對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)地采集的18批荔枝蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)荔枝蜜的揮發(fā)性成分組成、不同蜂種荔枝蜜揮發(fā)性成分的差異進(jìn)行系統(tǒng)分析和評(píng)價(jià)，可有效區(qū)分中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 蜂蜜樣品

研究所用蜂蜜樣品均是在荔枝植物的開(kāi)花流蜜季節(jié)（2018年3月～5月）采自中國(guó)華南地區(qū)。所有樣品直接從蜂農(nóng)手中獲得，檢測(cè)前一直置于4℃條件下保存。其中中蜂荔枝蜜7份，意蜂荔枝蜜11份，驗(yàn)證樣品中蜂和意蜂荔枝蜜各5份，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 荔枝蜜樣品采集信息表Table 1 Information of collected honey samples

續(xù)表1 荔枝蜜樣品采集信息表Continue table 1 Information of collected honey samples

1.2 儀器設(shè)備

7890B-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置分流/不分流進(jìn)樣口和固相微萃取專(zhuān)用襯管）、Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó) Agilent公司；MPS多功能樣品前處理平臺(tái)（配置自動(dòng)化頂空固相微萃取手柄）：德國(guó)Gerstel公司。

1.3 試劑與材料

固相微萃取纖維：50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 和 65 μm PDMS/DVB 4 種不同涂層的纖維頭：美國(guó)Sigma-Aldrich Supelco公司；20 mL頂空瓶：德國(guó)Gerstel公司；配置硅膠/聚四氟乙烯隔墊、20 mm鐵蓋、壓蓋器、啟蓋器：德國(guó)CNW科技公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理和SPME條件

準(zhǔn)確稱取（2.0±0.1）g蜂蜜樣品于20 mL頂空瓶中，加蓋密封后直接置于樣品前處理平臺(tái)上進(jìn)行固相微萃取。

SPME條件：萃取纖維為50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取溫度：60 ℃；平衡時(shí)間：20 min；震蕩速率：250 r/min；萃取時(shí)間：45 min；進(jìn)樣口解析時(shí)間：5 min。

1.4.2 GC-MS條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度270℃，載氣為高純氦，流量1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min，然后以3℃/min速率升至160℃，然后以10℃/min速率升至270℃，保持6 min。

MS條件：電子轟擊離子源（electron ionization，EI）70 eV；傳輸線溫度270℃；離子源溫度230℃；全掃描模式，掃描范圍為25～450 m/z。

1.4.3 定性定量方法

主要采用3種方法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性

1）將目標(biāo)色譜峰對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖扣除背景空白后，進(jìn)行NIST14譜庫(kù)檢索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物，即認(rèn)定為目標(biāo)物，由柱流失帶來(lái)的硅氧烷類(lèi)化合物不計(jì)在內(nèi)；

2）對(duì)相似度得分接近而保留指數(shù)（retention index，RI）有明顯差異的化合物，通過(guò)參考其RI值進(jìn)行定性；

3）部分同分異構(gòu)體質(zhì)譜圖相似，RI值差別也較小，則通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行保留時(shí)間驗(yàn)證，最終確定檸檬烯保留時(shí)間（retention time，RT）（RT：15.90）、丁香醛 A（RT：21.52）、丁香醛 B（RT：21.92）、丁香醛 D（RT：22.59）和萜品烯-4-醇（RT：23.37）。

采用面積歸一化法測(cè)定樣品中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量，對(duì)GC-MS總離子流色譜圖中目標(biāo)峰進(jìn)行積分和計(jì)算峰面積，每個(gè)目標(biāo)峰的面積與總峰面積之比，即為該目標(biāo)物的相對(duì)含量。除柱流失帶來(lái)的色譜峰之外，由樣品儲(chǔ)存介質(zhì)帶來(lái)的增塑劑類(lèi)（如鄰苯二甲酸酯等）色譜峰，也不計(jì)在目標(biāo)峰內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPME參數(shù)選擇和優(yōu)化

2.1.1 萃取纖維纖維的選擇

萃取纖維的選擇決定了萃取目標(biāo)物的種類(lèi)和數(shù)量。本研究考察了最常用的50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 和 65 μm PDMS/DVB 4種不同涂層的纖維對(duì)某代表性荔枝蜜揮發(fā)性成分的萃取效果。結(jié)果表明，DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB纖維萃取的數(shù)量分別為92、86種，CAR/PDMS、PDMS、PDMS/DVB 分別為60、71種。DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB纖維對(duì)蜂蜜揮發(fā)性成分萃取的數(shù)量要明顯多于另外兩種纖維，與Pearez R A[23]和Ceballos L[24]等報(bào)道一致。由于DVB/CAR/PDMS較PDMS/DVB纖維吸附揮發(fā)性成分的極性范圍更廣，在蜂蜜中揮發(fā)性成分的研究中應(yīng)用更為廣泛[10，14，18，21]，因而本研究選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維。

2.1.2 萃取溫度的選擇

試驗(yàn)考察 30、40、50、60、70 ℃的溫度下樣品中揮發(fā)性成分的萃取效果。結(jié)果表明，在不超過(guò)60℃條件下，隨著萃取溫度的升高，目標(biāo)峰的總峰面積從1.24×109增加到1.45×109，響應(yīng)值逐漸增高，60℃和70℃條件下大多數(shù)目標(biāo)峰響應(yīng)值變化不大，分別為1.45×109、1.42×109。由于溫度過(guò)高會(huì)使蜂蜜中部分揮發(fā)性成分發(fā)生變化，當(dāng)超過(guò)70℃條件下羥甲基糠醛含量會(huì)升高[25]，而一般認(rèn)為60℃以下蜂蜜的主要成分不發(fā)生明顯變化，因而選擇60℃為萃取溫度。

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇

考察萃取時(shí)間為 10、20、30、45、60、90 min 條件下樣品中揮發(fā)性成分的萃取效果。結(jié)果表明，在不超過(guò)45 min條件下，隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，總峰面積從6.97×108到1.41×109，大部分揮發(fā)性成分的響應(yīng)值逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)萃取時(shí)間再增加至60 min或90 min時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)值變化不大，分別為 1.39×109、1.40×109。為保證目標(biāo)物具有較高的響應(yīng)值同時(shí)節(jié)約分析時(shí)間，選取45 min為萃取時(shí)間。

2.2 荔枝蜜的揮發(fā)性成分

中蜂和意蜂荔枝蜜樣品的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，荔枝蜜中揮發(fā)性成分均得到良好的分離，18批荔枝蜜中共檢測(cè)出98種揮發(fā)性成分，中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量見(jiàn)表2。

圖1 中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量Table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

續(xù)表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量Continue table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

續(xù)表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量Continue table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

由表2可知，中蜂荔枝蜜檢出93種，意蜂荔枝蜜檢出85種。荔枝蜜揮發(fā)性成分主要包括醇類(lèi)、芳香族類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、萜烯類(lèi)、酮類(lèi)、烷烴類(lèi)、酯類(lèi)等，另有15個(gè)目標(biāo)峰未鑒定具體化合物種類(lèi)（標(biāo)記為未知峰）。

中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜揮發(fā)性成分種類(lèi)比對(duì)如圖2所示。

由圖2可知，中蜂荔枝蜜的揮發(fā)性成分主要由萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)組成，這4類(lèi)揮發(fā)性成分的含量占揮發(fā)性成分的86.29%。意蜂荔枝蜜的揮發(fā)性成分主要由萜烯類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)和芳香類(lèi)組成，這4類(lèi)揮發(fā)性成分的含量占揮發(fā)性成分的86.62%。中蜂和意蜂荔枝蜜中萜烯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量均最高，分別占揮發(fā)性成分的64.65%和64.28%。醇類(lèi)化合物在中蜂荔枝蜜中含量相對(duì)較高，占到揮發(fā)性成分的7.86%，而意蜂荔枝蜜中醛類(lèi)化合物含量相對(duì)比較高，占揮發(fā)性成分的12.27%。

圖2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發(fā)性成分的種類(lèi)及相對(duì)含量Fig.2 Volatile compounds types and amount of lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

所有樣品中含量最高的揮發(fā)性成分均為芳樟醇氧化物，中蜂荔枝蜜中平均含量占到51.40%，意蜂荔枝蜜中占37.56%，該結(jié)果與泰國(guó)荔枝蜜一致[5]。

2.3 中蜂和意蜂荔枝蜜揮發(fā)性成分對(duì)此分析

文獻(xiàn)報(bào)道不同蜂種的蜜蜂會(huì)對(duì)同一種蜜源植物的揮發(fā)性成分產(chǎn)生一定影響[5，26]。本研究進(jìn)一步詳細(xì)對(duì)比了中蜂和意蜂荔枝蜜揮發(fā)性成分的異同，由表2數(shù)據(jù)可知，中蜂和意蜂荔枝蜜揮發(fā)性成分中共有成分為80種，占總揮發(fā)性成分的81.63%，說(shuō)明不同蜂種荔枝蜜揮發(fā)性成分整體上相似，但二者也都存在各自的差異性成分。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，庚醇、乙酸苯乙酯、正壬醇、丁香醇等化合物只在中蜂釀造的荔枝蜜中檢出，在意蜂荔枝蜜中未發(fā)現(xiàn)，且具有顯著性差異。而在意蜂釀造的荔枝蜂蜜樣品中，癸醛、環(huán)氧芳樟醇氧化物和某未知峰（RT：27.98）均檢出，中蜂荔枝蜜樣品中則均未出現(xiàn)，且具有顯著性差異。差異揮發(fā)性成分的含量見(jiàn)圖3，通過(guò)其異同可以有效區(qū)分中蜂和意蜂荔枝蜜，為不同蜂種釀造的荔枝蜜的鑒別提供了新的技術(shù)手段。

通過(guò)方差分析，進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表可見(jiàn)，正庚醇、正壬醛、丁香醇、乙酸苯甲酯、癸醛、環(huán)氧芳樟醇氧化物和未知峰（RT：27.98）在中蜂和意蜂荔枝蜜中存在明顯差異，分別為中蜂和意蜂的差異性成分，可以對(duì)中蜂和意蜂進(jìn)行區(qū)分鑒別。試驗(yàn)結(jié)果可靠。

圖3 中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜中差異揮發(fā)性成分Fig.3 Different volatile compounds of lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

表3 中蜂和意蜂荔枝蜜中差異揮發(fā)性成分相對(duì)含量Table 3 Amount of different volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）-氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)地采集的18批荔枝蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出98種揮發(fā)性成分，其中含量最多的均為萜烯類(lèi)物質(zhì)。正庚醇、正壬醇、乙酸苯乙酯、丁香醇僅在中蜂荔枝蜜被檢出，而癸醛、環(huán)氧芳樟醇氧化物和某未知色譜峰（RT：27.98）僅在意蜂荔枝蜜中被檢出。通過(guò)差異揮發(fā)性成分可以有效區(qū)分中蜂和意蜂荔枝蜜，為不同蜂種釀造的荔枝蜜的鑒別提供了新的技術(shù)手段。