山楂不同溶劑提取物的抗氧化活性及對DNA和蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用

張亮亮，張展諾，閆可婧，額日赫木，張麗芳，徐建國，*

（1.山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004；2.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名紅果、山里紅等，屬薔薇科，是一種多年生木本植物，在我國北方廣泛種植。山楂是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用水果，營養(yǎng)豐富，具有消食健胃、行氣散瘀的功效[1-2]。許多研究表明，山楂富含維生素C（890 mg/kg FW）、多糖（10.23%～14.25%）、多酚（61.84 mg RE/g）、黃酮（33.56 mg GAE/g）等功能性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、降血糖、降血脂和神經(jīng)保護(hù)等活性作用[1-6]。鐘麗霞等[6]優(yōu)化了山楂多糖的提取條件，并表明山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂活性；何彩梅等[7]研究了山楂70%乙醇提取物的組成成分及抗氧化能力；張曉波等[8]研究了不同品種山楂80%丙酮提取物的抗氧化能力；努爾阿麗耶·阿卜力米提等[4]研究了新疆山楂水和乙醇提取物的清除自由基能力及抑菌作用。除此之外，研究表明山楂原花青素可通過影響抗氧化酶活力和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白來抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。

但目前有關(guān)不同溶劑對山楂提取物的活性物質(zhì)含量及其生物活性影響的研究還未見詳細(xì)報道。為有效開發(fā)山楂資源，本文對山楂不同溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。本研究以山楂為材料，采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等6種不同極性的溶劑分別提取山楂中的總黃酮、總多酚類物質(zhì)，分析其主要的化學(xué)成分，研究不同溶劑提取物的抗氧化能力及其對DNA和蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用，為山楂資源的開發(fā)利用及功能食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大金星山楂：10月上旬采摘于本地果園，經(jīng)去核、晾干后粉碎，密封低溫保存?zhèn)溆?。兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、槲皮素、對苯二甲酸、金絲桃苷、異槲皮苷：上海源葉生物科技有限公司；1，1苯基-2-苦 肼 基 自 由 基 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-3-乙苯-二噻唑-6 磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、Fe3+-三吡啶三吖嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：Sigma公司；pBR322質(zhì)粒DNA：大連寶生物公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)有限公司。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Centrifuge 5804R型冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取物制備

準(zhǔn)確稱取干燥的山楂，粉碎過40目篩，按照1∶10（g/mL）的料液比，分別加入不同溶劑，25℃振蕩2 h，收集上清液，重復(fù)3次。將上清液混合后減壓濃縮，將得到的浸膏經(jīng)真空冷凍干燥，分別得到甲醇提取物（methanol extract，ME）、乙醇提取物（ethanol extract，EE）、丙酮提取物（acetone extract，AE）、乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract，EAE）、氯仿提取物（trichloromethane extract，TE）和石油醚提取物（petroleum ether extract，PE）。

1.2.2 總黃酮含量測定

參照文獻(xiàn)[9]的試驗方法，稱取一定量的提取物，溶解，取0.1mL樣液，加入0.15mL5%NaNO2溶液，25℃放置6 min后加入0.15 mL濃度為10%的Al（NO3）3溶液，反應(yīng)6 min，加入4%的NaOH溶液2 mL，并用蒸餾水定容到5 mL，反應(yīng)3 min后，測定混合液在508 nm處的吸光度值。同時以蘆丁標(biāo)品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的回歸方程y=2.403 5x+0.004 9（R2=0.999 2）?？傸S酮含量測定結(jié)果以每克山楂中所含的蘆丁（rutin）的量表示（mg RE/g）。

1.2.3 總多酚含量測定

參照文獻(xiàn)[9]的試驗方法，準(zhǔn)確移取0.1 mL樣液，向其中加入2.8 mL蒸餾水，0.1 mL 1 mol/L的Folin-酚試劑，混勻，25℃避光反應(yīng)8 min，再加入2 mL 7.5%Na2CO3，避光2 h，測其在765 nm處的吸光度值。以沒食子酸標(biāo)品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程為y=1.558 2x+0.008 2（R2=0.999 6）?？偠喾雍康臏y定結(jié)果以每克山楂中所含的沒食子酸的量表示（mg GAE/g）。

1.2.4 組成成分分析

提取物的成分分析方法參照文獻(xiàn)[10]略作修改。選用 C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），采用三氟乙酸（1%）作為流動相 A，用乙腈/甲醇（80∶20，體積比）作為流動相B。進(jìn)樣量為10 μL，柱溫保持在35℃，流動相下洗脫流速1 mL/min，洗脫過程為：0～5 min，3%B；5min～12min，3%～10%B；12min～25min，10%～18%B；25 min～35 min，18%～20%B；35 min～40 min，20%～80%B；40 min～45 min，80%～3%B；45 min～50 min，3%B。各組分在280 nm的吸光度值被檢測。標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、槲皮素、對苯二甲酸、金絲桃苷、異槲皮苷在同樣的條件下進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，并以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品成分根據(jù)對比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定

參考文獻(xiàn)[11]的方法，量取500 μL不同濃度的山楂提取物于試管中，添加2.5 mL的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min，測量其在517 nm波長處的吸光度值，計算DPPH自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率為50%時添加的提取物的濃度）表示。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測定

參考文獻(xiàn)[11]的方法，量取100 μL不同濃度的山楂提取物于試管中，添加3.8 mL的ABTS溶液，避光反應(yīng)6 min，在734 nm處測定吸光度值，計算ABTS自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率為50%時添加的提取物的濃度）表示。

1.2.7 鐵還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

參考文獻(xiàn)[11]的方法，量取100 μL山楂提取物于試管中，加TPTZ溶液1.8 mL，37℃反應(yīng)30 min，立即記錄反應(yīng)體系在593 nm處的吸光度值。同時以FeSO4·7H2O 做標(biāo)準(zhǔn)曲線（100 μmol/L～1 000 μmol/L），得回歸方程為 y=0.000 6x+0.003 5（R2=0.993 8），鐵還原能力結(jié)果以每克山楂相當(dāng)于μmol Fe（II）表示（μmol Fe（II）/g）。

1.2.8 蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)試驗

試驗方法參考文獻(xiàn)[12]，量取5 μL1 mg/mL的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，依次加入5 μL 山楂提取物、5 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 緩沖溶液、2.5 μL10 mmol/L 的硫酸銅溶液和 2.5 μL 雙氧水（50 mmol/L），搖勻，放入 37℃水浴1 h。空白組用PBS緩沖液替代山楂提取物。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白質(zhì)，在凝膠成像記錄儀中拍照，并通過灰度值計算其相對保護(hù)率。

1.2.9 DNA氧化損傷的保護(hù)試驗

試驗方法參考文獻(xiàn)[11]，取1 μL的pBR322 DNA，加入 14 μL 的 PBS 緩沖溶液（pH 7.4），5 μL 山楂提取物，然后加入2.5 μL 1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2.5 μL 1 mmol/L雙氧水，混合均勻并置于37℃水浴中反應(yīng)30 min，取出后立即進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，在凝膠成像記錄儀中拍照，并通過灰度值計算其相對保護(hù)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)采用Excel 2013、SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物中總黃酮、總多酚含量

山楂不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量測定結(jié)果見圖1。

圖1 不同溶劑提取物中總黃酮和總多酚含量Fig.1 Contents of total phenolics and flavonoids of different solvents extracts

由圖1得知，不同提取物中的總黃酮含量存在明顯差異，其中ME中總黃酮的含量最高（61.84mgRE/g），其次為 EE（44.42 mg RE/g）、AE（12.78 mg RE/g）、EAE（3.08 mg RE/g）、TE（2.59 mg RE/g），PE中總黃酮含量最低為0.59 mg RE/g。與總黃酮含量的變化相似，ME中總多酚含量最高為38.40 mg GAE/g，EE中多酚含量為37.99 mg GAE/g，但ME和EE二者之間總多酚含量無顯著差異；其余提取物中總多酚含量由高到低依次為 AE（33.56 mg GAE/g）、EAE（17.12 mg GAE/g），TE（4.48 mg GAE/g）和 PE（2.66 mg GAE/g）。試驗結(jié)果表明，隨著提取溶劑極性的不斷增加，山楂中總黃酮和總酚類物質(zhì)的溶解程度也隨之增加，這與一些以前的研究報道相一致[9，13]，符合酚類物質(zhì)主要為溶解在中等和高極性溶劑中的特征。然而提取劑極性與酚類物質(zhì)含量并非一一對應(yīng)，如田強(qiáng)等[14]報道厚樸葉的乙醇提取物中的總酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其甲醇提取物；陸健等[15]報道大麥的丙酮提取物中多酚的含量大于甲醇提取物。這些差異可能與原料種類、產(chǎn)地、提取方法及其酚類物質(zhì)的組成成分有關(guān)。

2.2 不同提取物的成分組成

不同提取物成分含量見表1。

表1 不同提取物成分含量Table 1 Chemical components in extracts of different solvents mg/100 g DW

由表1可知，不同溶劑提取物中含有的物質(zhì)種類和含量存在明顯差異，在ME、EE和AE中檢測到全部8種物質(zhì)，EAE未檢測到異槲皮苷，TE中檢測到6種物質(zhì)，而PE中只檢測到原花青素B2、表兒茶素和金絲桃苷3種物質(zhì)。總的來看，每種提取物中，表兒茶素和原花青素B2的含量較高，其次為綠原酸、槲皮素。EE中含有最高的兒茶素，其次為ME和AE；而對于其他每種物質(zhì)成分，其含量最高的被發(fā)現(xiàn)在ME中，其次為EE、AE、EAE、TE 和 PE。

2.3 不同提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力

山楂不同提取物的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑提取物的自由基清除能力Table 2 DPPH and ABTS free radicals scavenging ability of different solvent extracts

不同提取物對DPPH自由基和ABTS自由基具有不同程度的清除作用，在測定濃度范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系。ME和EE清除DPPH自由基能力顯著強(qiáng)于其它提取物，其 IC50值分別為 2.43、3.22 mg/mL，其次為 AE、EAE、TE和PE。不同提取物對ABTS自由基的清除能力與DPPH自由基的清除能力相一致，清除能力由強(qiáng)到弱依次為 ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE。

2.4 山楂提取物的鐵還原能力

山楂不同溶劑提取物的鐵還原能力測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑提取物鐵還原能力Fig.2 FARP value of different solvent extracts

由圖2可以看出，提取溶劑對提取物的鐵還原能力有顯著的影響。ME的鐵還原能力最強(qiáng)，為2.88 mmol Fe（II）/g，其次為 EE（2.17 mmol Fe（II）/g）和AE（0.91 mmol Fe（II）/g）；EAE、TE 和 PE 的鐵還原能力沒有顯著差異，分別為 1.74、1.12、1.08 mmol Fe（II）/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它提取物。

2.5 不同提取物對蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)效果

Cu2+、Fe2+、Fe3+等金屬離子可以催化雙氧水，產(chǎn)生能與氨基酸反應(yīng)的·OH[16]，本試驗通過Cu2+-H2O2體系產(chǎn)生·OH，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的氧化損傷，考察山楂提取物對蛋白質(zhì)損傷的保護(hù)作用，試驗結(jié)果見圖3。

圖3 不同溶劑提取物對蛋白質(zhì)損傷的保護(hù)效果Fig.3 Protective effects of different solvent extracts on protein oxidative damage

在蛋白質(zhì)氧化損傷的反應(yīng)體系中，提取物可能會通過直接清除羥基自由基來保護(hù)蛋白質(zhì)[17]。不同溶劑提取物處理組中，ME對蛋白質(zhì)的保護(hù)率達(dá)到了55.78%，其次為EE、AE對蛋白質(zhì)的保護(hù)率分別為53.12%和37.25%，EAE對蛋白質(zhì)的保護(hù)率為25.94%，而TE和PE對蛋白質(zhì)的氧化損傷基本上起不到保護(hù)作用。

2.6 不同提取物對DNA氧化損傷的保護(hù)效果

天然存在的pBR322 DNA呈超螺旋結(jié)構(gòu)，受外界因素?fù)p傷導(dǎo)致其中一條鏈斷裂變?yōu)殚_環(huán)形，兩條鏈斷裂變?yōu)榫€型，通過檢測pBR322 DNA構(gòu)象的改變，可反映DNA氧化損傷程度[18-19]。山楂提取物對DNA損傷的保護(hù)作用結(jié)果見圖4。

由圖4可知，ME、EE對DNA的氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，保護(hù)率分別達(dá)到了74.14%、63.17%，AE對DNA氧化損傷的保護(hù)率為31.35%，EAE為17.06%，TE和PE對DNA氧化損傷沒有保護(hù)作用，保護(hù)率僅為2.41%和0.43%。

2.7 總多酚、黃酮含量與生物活性的相關(guān)性分析

山楂提取物中總多酚、總黃酮含量與其生物活性的相關(guān)性分析結(jié)果見圖5。

圖4 不同溶劑提取物對DNA損傷的保護(hù)效果Fig.4 Protective effects of different solvent extracts on DNA oxidative damage

圖5 總多酚、黃酮及生物活性的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of total polyphenols，flavonoids and biological activities

不同溶劑提取物中總酚含量、黃酮含量與其抗氧化能力、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均不小于0.794，且相關(guān)性顯著（P＜0.05）。這些結(jié)果與以前的一些報道相一致[14，20-21]，說明山楂提取物總多酚、黃酮含量的多少可以反映其抗氧化能力及其對蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力的強(qiáng)弱。除此之外，提取物的抗氧化能力、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力之間的相關(guān)性亦呈顯著正相關(guān)，說明這幾種方法適合測定并能綜合反應(yīng)山楂提取物的抗氧化能力

3 結(jié)論

本研究比較了山楂不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量，隨著提取溶劑極性的增強(qiáng)，提取物中總多酚和總黃酮的含量隨之增加，即ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE，表明山楂中極性多酚的含量較高。

分析測定了提取物的組成成分、體外生物活性及其相關(guān)性。通過5種評價體系可知，山楂的不同溶劑提取物中ME、EE和AE表現(xiàn)出較好的抗氧化能力及其對蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力，而EAE、TE和PE的生物活性相對較弱，山楂提取物中總多酚和總黃酮含量與其生物活性具有顯著正相關(guān)性。本試驗通過研究不同溶劑對山楂提取物活性成分及其生物活性的影響，為山楂資源的深度開發(fā)提供參考，但其活性單體的分離純化、生物活性及其之間相互作用，均有待于進(jìn)一步深入研究和探討。