蟲(chóng)草素的N-丙烯?；男揎?/h1>
2020-04-08 03:30:20金英今張敬東王思宏李東浩
食品研究與開(kāi)發(fā) 2020年7期
金英今，張敬東，王思宏，*，李東浩
（1.延邊大學(xué)分析測(cè)試中心，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉133002）
冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名貴中藥材，具有重要的食用與藥用價(jià)值。冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血壓、抗氧化、抗疲勞等多種活性功能，有極高的藥用價(jià)值，可作為藥材與其它中藥配伍，從而起到治療疾病的效果[1-2]。蟲(chóng)草素（cordy－cepin）[3-5]為冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草的活性成分之一[6]。1997年被美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于淋巴細(xì)胞白血病的臨床試驗(yàn)[7]。1976年，Johns等發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素進(jìn)入生物體內(nèi)后容易被腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）分解，為降低分解程度，臨床上需與腺苷脫氨酶抑制劑配對(duì)使用，或者對(duì)它的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾除了能夠降低蟲(chóng)草素在生物體內(nèi)的分解率，還可能賦予蟲(chóng)草素新的生物功效，比如作為前藥而發(fā)揮作用，蟲(chóng)草素在ADA作用下快速脫氨基對(duì)其單獨(dú)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很大的局限性，也使其作為藥物進(jìn)行研發(fā)造成了一定的困難。蟲(chóng)草素進(jìn)入動(dòng)物體后，主要是分子結(jié)構(gòu)中的伯氨基容易被快速氧化。因此，如果通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的手段，將該伯氨基用酰胺鍵保護(hù)起來(lái)，就有可能阻止其快速氧化，從而起到減緩蟲(chóng)草素在體內(nèi)的代謝速度的作用。以蟲(chóng)草素為先導(dǎo)化合物，對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并創(chuàng)造出新的衍生物，是蟲(chóng)草素開(kāi)發(fā)利用最好的途徑。所以未來(lái)蟲(chóng)草素在生物體內(nèi)作用效率的研究重點(diǎn)將放在它的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾方面上[8-9]。
aza-Michael反應(yīng)是氨基與烯烴的共軛加成，被認(rèn)為是100%原子效率。反應(yīng)條件溫和，收率較高。該反應(yīng)被廣泛關(guān)注和應(yīng)用于藥物和天然產(chǎn)物的制備中，aza-Michael反應(yīng)是制備功能性烷氧基硅烷的有效途徑之一。功能化磁性材料由于具有超順磁性、良好的生物相容性和較高的結(jié)合能力，大規(guī)模的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)樣品制備中。
因此以蟲(chóng)草素為原料，丙烯酰氯為?；瘎ㄟ^(guò)?；磻?yīng)，合成N-丙烯酰蟲(chóng)草素。并與含氨基物質(zhì)發(fā)生aza-Michael反應(yīng)見(jiàn)圖1。
圖1 N-丙烯酰蟲(chóng)草素合成的反應(yīng)路線及aza-Michael反應(yīng)Fig.1 Reaction route and aza-Michael reaction of N-acrylamide cordycepin
擬進(jìn)行修飾的蟲(chóng)草素與磁性材料雜化[10]。本文的研究將促進(jìn)蟲(chóng)草素的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)，對(duì)其他天然藥物和功能材料的研究和開(kāi)發(fā)具有方法學(xué)上的指導(dǎo)意義和借鑒作用。
1 試驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
AV-300核磁共振儀、maXis高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：Bruker公司；MPMS-XL-7振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)：美國(guó)Quantum Design公司；KH-50高壓釜：上海裕英儀器有限公司；SZ-93自動(dòng)雙重蒸餾水器：上海亞榮生化儀器廠；柱層析硅膠（300目～400目）、GF254型薄層層析硅膠：青島海洋化工有限公司。
釹鐵強(qiáng)磁鐵：寧波永磁磁性材料廠；蟲(chóng)草素、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、二甲基亞砜-d6（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）、甲 醇 -d4（methanol-d4，CD3OD-d4）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、丙烯酰氯、茚三酮、三乙胺（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；四水合氯化亞鐵、濃氨水、二氯甲烷、氯仿、石油醚（40℃～60℃）、甲醇、乙醇、無(wú)水硫酸鎂（分析純）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司。
1.2 N-丙烯酰蟲(chóng)草素的合成
參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行丙烯?；磻?yīng)[11]。在磁攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將丙烯酰氯（5 μL，0.02 mmol）用二氯甲烷（2 mL）溶解后，冰水浴下，滴入用二氯甲烷（2 mL）溶解的蟲(chóng)草素（5 mg，0.02 mmol）和三乙胺（3 μL，0.02 mmol）中，攪拌 1 h 后，加入石油醚（2 mL），析出白色沉淀，過(guò)濾，濾液濃縮，加水，乙酸乙酯（2 mL）提取3次，合并，無(wú)水硫酸鎂干燥，然后用硅膠柱（300目～400目硅膠）純化，洗脫液為氯仿∶甲醇=20∶1（體積比），將所得洗脫液濃縮，得到白色薄片狀產(chǎn)物，收率為96%。采用b型管測(cè)定熔點(diǎn)，化合物的熔點(diǎn)測(cè)定值未進(jìn)行校正。蟲(chóng)草素熔點(diǎn)：229℃～230℃，N-丙烯酰蟲(chóng)草素熔點(diǎn)：126℃～127℃。比移值（Rf）0.76（氯仿 ∶甲醇=9∶1，體積比）。
1.3 N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲(chóng)草素的合成
利用N-丙烯酰蟲(chóng)草素的aza-Michael反應(yīng)進(jìn)行合成。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（4.0 mg，0.02 mmol），N-丙烯酰蟲(chóng)草素（6.0 mg，0.02 mmol），甲醇（7 mL），室溫22℃反應(yīng)2 d，產(chǎn)品為無(wú)色油狀物（100%）。Rf 0.33，氯仿 ∶甲醇=9∶1（體積比）。
1.4 Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素的合成
Fe3O4-NH2的水熱法合成。將四水合氯化亞鐵（1.25 g）溶解于7.75 mL水中。在劇烈攪拌下，添加濃氨水（6.25 mL），將懸浮液在空氣中連續(xù)攪拌10 min，使Fe（II）氧化。然后，加入2.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，將反應(yīng)混合物放在體積為50 mL、溫度為130℃的KH-50高壓釜密封壓力容器中，3 h，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫（22℃），F(xiàn)e3O4-NH2反復(fù)用5次蒸餾水洗滌，除去水溶性雜質(zhì)[12]。
利用aza-Michael反應(yīng)的Fe3O4-NH2的表面修飾。取干燥的兩頸瓶，加入DMF，稱(chēng)取干燥的Fe3O4-NH2粉末，得到Fe3O4-NH2的分散液，在分散液中加入N-丙烯酰蟲(chóng)草素，機(jī)械攪拌3 d，在釹鐵強(qiáng)磁鐵輔助下，用甲醇和水反復(fù)洗滌5次[10]。
1.5 抗菌活性測(cè)試
參照本課題組發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行，采用屎腸球菌Enterococcus faecalis 3511測(cè)試抗菌活性[13]。
2 結(jié)果與討論
蟲(chóng)草素分子結(jié)構(gòu)中，芳伯氨基和糖分子上的羥基均可能和烷酰氯發(fā)生酚化反應(yīng)。但顯然芳伯胺基的氫比羥基氫活潑得多，當(dāng)蟲(chóng)草素分子和烷酰氯發(fā)生?；磻?yīng)的時(shí)候，是芳伯胺基首先和烷酰氯發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物。反應(yīng)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制反應(yīng)物的量、試劑滴加的速度和反應(yīng)溫度，以防止副產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。此外，應(yīng)控制反應(yīng)物中水分含量，以防止烷酰氯和反應(yīng)體系中的水分反應(yīng)生成大量的酸，否則會(huì)影響給反應(yīng)物的純化。丙烯酰氯因分子結(jié)構(gòu)中含碳碳不飽和雙鍵和氯原子基團(tuán)，能發(fā)生多種類(lèi)型的化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而衍生出較多種有機(jī)化合物[11]，故選擇其為酰化試劑。
DMSO-d6作為溶劑蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，δ：8.33（1H，s，2-H），8.11（1H，s，8-H），7.25（2H，s，-NH2），5.835（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.625（1H，d，J=3.0 Hz，2`-H），5.13 （1H，m，4`-H），4.56 （1H，m，2`-OH），4.33（1H，m，5`-OH），3.65-3.95（1H，m，5`-Ha），3.51 （1H，m，5`-Hb），2.25-2.18 （1H，m，3`-Ha），1.92（1H，m，3`-Hb）。CD3OD-d4作為溶劑蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)。CD3OD-d4作為溶劑蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.70 （1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675 （1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），見(jiàn)圖 2。
因?yàn)槿軇┬?yīng)，蟲(chóng)草素的CD3OD-d4和DMSO-d6核磁共振譜圖表現(xiàn)出差異。DMSO-d6作為溶劑蟲(chóng)草素展現(xiàn)了所有的氫的核磁共振吸收峰，而CD3OD-d4作為溶劑的蟲(chóng)草素中的氨基和羥基因?yàn)榕c氘代試劑中活潑氫都未出現(xiàn)核磁共振吸收峰，而譜圖裂分精細(xì)，CD3OD-d4作為溶劑譜圖的峰盡管失去活潑氫的信息，但是有良好的分辨度，因而N-丙烯酰蟲(chóng)草素選用CD3OD-d4作為溶劑測(cè)試核磁共振氫譜。
CD3OD-d4作為溶劑N-丙烯酰蟲(chóng)草素核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖 2。核磁共振氫譜（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），6.15（1H，dd，J=3.0，6.0 Hz，3``-H），5.955（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.645（2H，dd，J=3.0，6.0 Hz，4``-H），4.70（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb）。核磁共振碳譜（CD3OD-d4，75 MHz），δ：177.4（C-2``），157.4（C-2），153.6（C-6），149.9（C-4），141.1（C-8），134.0（C-3``），127.7（C-4``），120.7（C-5），93.6（C-1`），82.6（C-4`），76.6（C-2`），64.2（C-5`），34.5（C-3`）。135度無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)圖譜（CD3OD，75 MHz），δ：153.61（CH，C-6），141.14（CH，C-8），134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），120.7（CH，C-5），93.6（CH，C-1`），82.6（CH，C-4`），76.6（CH，C-2`），64.2（CH2，C-5`），34.5（CH2，C-3`）。二維氫氫相關(guān)譜中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）；3.925（5`-Ha），3.675（5`-Hb）；2.38（3`-Ha），2.06（3`-Hb）是相關(guān)的。高分辨質(zhì)譜，m/z：304.1122[M-H]-，計(jì)算值：305.112 4。
圖2 蟲(chóng)草素和N-丙烯酰蟲(chóng)草素核磁共振譜對(duì)比圖Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectra of cordycepin and N-acrylamide cordycepin
比較蟲(chóng)草素和N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜圖，觀察新增或減少的質(zhì)子峰的種類(lèi)和數(shù)量與目標(biāo)化合物N-丙烯酰蟲(chóng)草素的吻合程度。N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)中新出現(xiàn)δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰，核磁共振碳譜中新出現(xiàn)177.4（C-2``），134.0（C-3``），127.7（C-4``）峰，135 度無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)圖譜中新出現(xiàn) 134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），二維氫氫相關(guān)譜中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰具有相關(guān)性，異核多量子相關(guān)譜圖（HMQC）中δ：6.15（3``-H）對(duì)應(yīng) δ：134.0（C-3``），δ：5.645（4``-H）對(duì)應(yīng)δ：127.7（C-4``），是丙烯酰中的烯鍵氫的相關(guān)性。因?yàn)榘被挠H核性大于羥基，丙烯酰反應(yīng)保留了蟲(chóng)草素的糖原部分，丙烯酰反應(yīng)選擇性發(fā)生在蟲(chóng)草素中的氨基部分。綜上幾種核磁譜圖和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合生成產(chǎn)物的Rf值、熔點(diǎn)等理化參數(shù)，也進(jìn)一步印證了蟲(chóng)草素連接上丙烯酰鍵[6]。
3-氨基丙基三乙氧基硅烷與N-丙烯酰蟲(chóng)草素中烯烴發(fā)生了aza-Michael反應(yīng)，核磁共振氫譜中（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.41 （1H，s，2-H），8.19（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.705（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.53（1H，m，4`-H），3.92（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.67（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），3.34 （m，2H，CH2），2.71（m，2H，CH2），2.64（m，2H，CH2），2.36（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.065（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），1.63（m，8H，4×CH2），0.65（m，9H，3×CH3）。核磁共振碳譜（CD3OD-d4，75 MHz），δ：173.7（C-2``），152.4（C-2），151.8（C-6），149.8（C-4），140.3（C-8），123.5（C-5），99.3（C-1`），82.4（C-4`），74.8（C-2`），63.8（C-5`），58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），34.5（C-3`），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2）。高分辨質(zhì)譜，m/z：527.256 9[M+H]+，計(jì)算值：526.257 1[14]。N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰消失，新增加了 δ：3.34（CH2），2.71（CH2），2.64（CH2），1.63（4×CH2），0.65（3×CH3）峰，以及核磁共振碳譜中134.0（C-3``），127.7（C-4``） 峰消失，新出現(xiàn) δ：58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2），N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜和核磁共振碳譜發(fā)生變化，對(duì)比N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜和核磁共振碳譜、高分辨質(zhì)譜、Rf值，表明3-氨基丙基三乙氧基硅烷與N-丙烯酰蟲(chóng)草素完成了反應(yīng)，生成了N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲(chóng)草素。借鑒這個(gè)模板反應(yīng)，利用aza-Michael反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)行表面含有氨基的磁性材料的修飾，通過(guò)茚三酮比色法、x射線粉末衍射、磁滯回線對(duì)比追蹤了雜化反應(yīng)進(jìn)程。
按《中國(guó)藥典》方法配制茚三酮溶液（2 g茚三酮，溶于100 mL乙醇即得）[15]，F(xiàn)e3O4-NH2中氨基的茚三酮反應(yīng)中是紫色，發(fā)生了aza-Michael反應(yīng)，反應(yīng)完全后紫色消失。Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素x射線粉末衍射圖譜見(jiàn)圖3。
圖3 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素x射線粉末衍射圖譜Fig.3 X-ray powder diffraction patterns of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin
由圖3所示，N-丙烯酰蟲(chóng)草素和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素衍射峰的變化。衍射峰的位置Theta 30°～60°有衍射峰，與磁鐵礦（Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS 89-4319） 的位置是一致的，Theta 15°～30°寬峰表明了顆粒的雜化中的有機(jī)化合物的存在。
雜化前Fe3O4-NH2磁飽和率為80.0 emu/g，雜化后Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素變?yōu)?0.0 emu/g，雜化前后磁飽和率的差異顯示蟲(chóng)草素被修飾了，見(jiàn)圖4。
圖4 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素磁滯回線Fig.4 Magnetic moments of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin
蟲(chóng)草素、N-丙烯酰蟲(chóng)草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）分別為 16、1.6、3.2 μg/mL。蟲(chóng)草素、N-丙烯酰蟲(chóng)草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素抗菌生理活性的差異，意味著蟲(chóng)草素修飾后氨基是穩(wěn)定的[16]。
3 結(jié)論
用反應(yīng)位點(diǎn)多的丙烯?；鶎?duì)蟲(chóng)草素中的氨基進(jìn)行了N-丙烯?；揎?，并結(jié)構(gòu)確認(rèn)，新合成出的N-丙烯酰蟲(chóng)草素，能100%與3-氨基丙基三乙氧基硅烷發(fā)生aza-Michael反應(yīng)，生成N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲(chóng)草素。借鑒這個(gè)思路，用N-丙烯酰蟲(chóng)草素進(jìn)行了水熱法合成的Fe3O4-NH2的表面修飾。蟲(chóng)草素經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后，可以達(dá)到延緩蟲(chóng)草素體內(nèi)代謝速度的目的。蟲(chóng)草素改變成丙烯酰后，其抗菌活性和蟲(chóng)草素相比，其對(duì)枯草桿菌的MIC降低了近10倍，是一個(gè)值得進(jìn)一步深入研究和有潛在開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的新化合物，藥物作用機(jī)制等問(wèn)題還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究和確證。
本文將生物、有機(jī)合成、有機(jī)無(wú)機(jī)雜化以及藥物化學(xué)理論應(yīng)用于天然藥物活性成分的研究開(kāi)發(fā)中，全面提升天然藥物活性成分的生產(chǎn)水平，大力降低其生產(chǎn)成本，并以天然活性成分為先導(dǎo)化合物、通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的手段研究開(kāi)發(fā)具有更高藥理活性的新型藥物，對(duì)其它天然藥物的研究和開(kāi)發(fā)具有方法學(xué)上的指導(dǎo)意義和借鑒作用。
金英今，張敬東，王思宏，*，李東浩
（1.延邊大學(xué)分析測(cè)試中心，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉133002）
冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名貴中藥材，具有重要的食用與藥用價(jià)值。冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血壓、抗氧化、抗疲勞等多種活性功能，有極高的藥用價(jià)值，可作為藥材與其它中藥配伍，從而起到治療疾病的效果[1-2]。蟲(chóng)草素（cordy－cepin）[3-5]為冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草的活性成分之一[6]。1997年被美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于淋巴細(xì)胞白血病的臨床試驗(yàn)[7]。1976年，Johns等發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素進(jìn)入生物體內(nèi)后容易被腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）分解，為降低分解程度，臨床上需與腺苷脫氨酶抑制劑配對(duì)使用，或者對(duì)它的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾除了能夠降低蟲(chóng)草素在生物體內(nèi)的分解率，還可能賦予蟲(chóng)草素新的生物功效，比如作為前藥而發(fā)揮作用，蟲(chóng)草素在ADA作用下快速脫氨基對(duì)其單獨(dú)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很大的局限性，也使其作為藥物進(jìn)行研發(fā)造成了一定的困難。蟲(chóng)草素進(jìn)入動(dòng)物體后，主要是分子結(jié)構(gòu)中的伯氨基容易被快速氧化。因此，如果通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的手段，將該伯氨基用酰胺鍵保護(hù)起來(lái)，就有可能阻止其快速氧化，從而起到減緩蟲(chóng)草素在體內(nèi)的代謝速度的作用。以蟲(chóng)草素為先導(dǎo)化合物，對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并創(chuàng)造出新的衍生物，是蟲(chóng)草素開(kāi)發(fā)利用最好的途徑。所以未來(lái)蟲(chóng)草素在生物體內(nèi)作用效率的研究重點(diǎn)將放在它的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾方面上[8-9]。
aza-Michael反應(yīng)是氨基與烯烴的共軛加成，被認(rèn)為是100%原子效率。反應(yīng)條件溫和，收率較高。該反應(yīng)被廣泛關(guān)注和應(yīng)用于藥物和天然產(chǎn)物的制備中，aza-Michael反應(yīng)是制備功能性烷氧基硅烷的有效途徑之一。功能化磁性材料由于具有超順磁性、良好的生物相容性和較高的結(jié)合能力，大規(guī)模的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)樣品制備中。
因此以蟲(chóng)草素為原料，丙烯酰氯為?；瘎ㄟ^(guò)?；磻?yīng)，合成N-丙烯酰蟲(chóng)草素。并與含氨基物質(zhì)發(fā)生aza-Michael反應(yīng)見(jiàn)圖1。
圖1 N-丙烯酰蟲(chóng)草素合成的反應(yīng)路線及aza-Michael反應(yīng)Fig.1 Reaction route and aza-Michael reaction of N-acrylamide cordycepin
擬進(jìn)行修飾的蟲(chóng)草素與磁性材料雜化[10]。本文的研究將促進(jìn)蟲(chóng)草素的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)，對(duì)其他天然藥物和功能材料的研究和開(kāi)發(fā)具有方法學(xué)上的指導(dǎo)意義和借鑒作用。
1 試驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
AV-300核磁共振儀、maXis高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：Bruker公司；MPMS-XL-7振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)：美國(guó)Quantum Design公司；KH-50高壓釜：上海裕英儀器有限公司；SZ-93自動(dòng)雙重蒸餾水器：上海亞榮生化儀器廠；柱層析硅膠（300目～400目）、GF254型薄層層析硅膠：青島海洋化工有限公司。
釹鐵強(qiáng)磁鐵：寧波永磁磁性材料廠；蟲(chóng)草素、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、二甲基亞砜-d6（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）、甲 醇 -d4（methanol-d4，CD3OD-d4）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、丙烯酰氯、茚三酮、三乙胺（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；四水合氯化亞鐵、濃氨水、二氯甲烷、氯仿、石油醚（40℃～60℃）、甲醇、乙醇、無(wú)水硫酸鎂（分析純）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司。
1.2 N-丙烯酰蟲(chóng)草素的合成
參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行丙烯?；磻?yīng)[11]。在磁攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將丙烯酰氯（5 μL，0.02 mmol）用二氯甲烷（2 mL）溶解后，冰水浴下，滴入用二氯甲烷（2 mL）溶解的蟲(chóng)草素（5 mg，0.02 mmol）和三乙胺（3 μL，0.02 mmol）中，攪拌 1 h 后，加入石油醚（2 mL），析出白色沉淀，過(guò)濾，濾液濃縮，加水，乙酸乙酯（2 mL）提取3次，合并，無(wú)水硫酸鎂干燥，然后用硅膠柱（300目～400目硅膠）純化，洗脫液為氯仿∶甲醇=20∶1（體積比），將所得洗脫液濃縮，得到白色薄片狀產(chǎn)物，收率為96%。采用b型管測(cè)定熔點(diǎn)，化合物的熔點(diǎn)測(cè)定值未進(jìn)行校正。蟲(chóng)草素熔點(diǎn)：229℃～230℃，N-丙烯酰蟲(chóng)草素熔點(diǎn)：126℃～127℃。比移值（Rf）0.76（氯仿 ∶甲醇=9∶1，體積比）。
1.3 N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲(chóng)草素的合成
利用N-丙烯酰蟲(chóng)草素的aza-Michael反應(yīng)進(jìn)行合成。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（4.0 mg，0.02 mmol），N-丙烯酰蟲(chóng)草素（6.0 mg，0.02 mmol），甲醇（7 mL），室溫22℃反應(yīng)2 d，產(chǎn)品為無(wú)色油狀物（100%）。Rf 0.33，氯仿 ∶甲醇=9∶1（體積比）。
1.4 Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素的合成
Fe3O4-NH2的水熱法合成。將四水合氯化亞鐵（1.25 g）溶解于7.75 mL水中。在劇烈攪拌下，添加濃氨水（6.25 mL），將懸浮液在空氣中連續(xù)攪拌10 min，使Fe（II）氧化。然后，加入2.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，將反應(yīng)混合物放在體積為50 mL、溫度為130℃的KH-50高壓釜密封壓力容器中，3 h，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫（22℃），F(xiàn)e3O4-NH2反復(fù)用5次蒸餾水洗滌，除去水溶性雜質(zhì)[12]。
利用aza-Michael反應(yīng)的Fe3O4-NH2的表面修飾。取干燥的兩頸瓶，加入DMF，稱(chēng)取干燥的Fe3O4-NH2粉末，得到Fe3O4-NH2的分散液，在分散液中加入N-丙烯酰蟲(chóng)草素，機(jī)械攪拌3 d，在釹鐵強(qiáng)磁鐵輔助下，用甲醇和水反復(fù)洗滌5次[10]。
1.5 抗菌活性測(cè)試
參照本課題組發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行，采用屎腸球菌Enterococcus faecalis 3511測(cè)試抗菌活性[13]。
2 結(jié)果與討論
蟲(chóng)草素分子結(jié)構(gòu)中，芳伯氨基和糖分子上的羥基均可能和烷酰氯發(fā)生酚化反應(yīng)。但顯然芳伯胺基的氫比羥基氫活潑得多，當(dāng)蟲(chóng)草素分子和烷酰氯發(fā)生?；磻?yīng)的時(shí)候，是芳伯胺基首先和烷酰氯發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物。反應(yīng)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制反應(yīng)物的量、試劑滴加的速度和反應(yīng)溫度，以防止副產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。此外，應(yīng)控制反應(yīng)物中水分含量，以防止烷酰氯和反應(yīng)體系中的水分反應(yīng)生成大量的酸，否則會(huì)影響給反應(yīng)物的純化。丙烯酰氯因分子結(jié)構(gòu)中含碳碳不飽和雙鍵和氯原子基團(tuán)，能發(fā)生多種類(lèi)型的化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而衍生出較多種有機(jī)化合物[11]，故選擇其為酰化試劑。
DMSO-d6作為溶劑蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，δ：8.33（1H，s，2-H），8.11（1H，s，8-H），7.25（2H，s，-NH2），5.835（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.625（1H，d，J=3.0 Hz，2`-H），5.13 （1H，m，4`-H），4.56 （1H，m，2`-OH），4.33（1H，m，5`-OH），3.65-3.95（1H，m，5`-Ha），3.51 （1H，m，5`-Hb），2.25-2.18 （1H，m，3`-Ha），1.92（1H，m，3`-Hb）。CD3OD-d4作為溶劑蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)。CD3OD-d4作為溶劑蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.70 （1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675 （1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），見(jiàn)圖 2。
因?yàn)槿軇┬?yīng)，蟲(chóng)草素的CD3OD-d4和DMSO-d6核磁共振譜圖表現(xiàn)出差異。DMSO-d6作為溶劑蟲(chóng)草素展現(xiàn)了所有的氫的核磁共振吸收峰，而CD3OD-d4作為溶劑的蟲(chóng)草素中的氨基和羥基因?yàn)榕c氘代試劑中活潑氫都未出現(xiàn)核磁共振吸收峰，而譜圖裂分精細(xì)，CD3OD-d4作為溶劑譜圖的峰盡管失去活潑氫的信息，但是有良好的分辨度，因而N-丙烯酰蟲(chóng)草素選用CD3OD-d4作為溶劑測(cè)試核磁共振氫譜。
CD3OD-d4作為溶劑N-丙烯酰蟲(chóng)草素核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖 2。核磁共振氫譜（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），6.15（1H，dd，J=3.0，6.0 Hz，3``-H），5.955（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.645（2H，dd，J=3.0，6.0 Hz，4``-H），4.70（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb）。核磁共振碳譜（CD3OD-d4，75 MHz），δ：177.4（C-2``），157.4（C-2），153.6（C-6），149.9（C-4），141.1（C-8），134.0（C-3``），127.7（C-4``），120.7（C-5），93.6（C-1`），82.6（C-4`），76.6（C-2`），64.2（C-5`），34.5（C-3`）。135度無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)圖譜（CD3OD，75 MHz），δ：153.61（CH，C-6），141.14（CH，C-8），134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），120.7（CH，C-5），93.6（CH，C-1`），82.6（CH，C-4`），76.6（CH，C-2`），64.2（CH2，C-5`），34.5（CH2，C-3`）。二維氫氫相關(guān)譜中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）；3.925（5`-Ha），3.675（5`-Hb）；2.38（3`-Ha），2.06（3`-Hb）是相關(guān)的。高分辨質(zhì)譜，m/z：304.1122[M-H]-，計(jì)算值：305.112 4。
圖2 蟲(chóng)草素和N-丙烯酰蟲(chóng)草素核磁共振譜對(duì)比圖Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectra of cordycepin and N-acrylamide cordycepin
比較蟲(chóng)草素和N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜圖，觀察新增或減少的質(zhì)子峰的種類(lèi)和數(shù)量與目標(biāo)化合物N-丙烯酰蟲(chóng)草素的吻合程度。N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)中新出現(xiàn)δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰，核磁共振碳譜中新出現(xiàn)177.4（C-2``），134.0（C-3``），127.7（C-4``）峰，135 度無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)圖譜中新出現(xiàn) 134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），二維氫氫相關(guān)譜中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰具有相關(guān)性，異核多量子相關(guān)譜圖（HMQC）中δ：6.15（3``-H）對(duì)應(yīng) δ：134.0（C-3``），δ：5.645（4``-H）對(duì)應(yīng)δ：127.7（C-4``），是丙烯酰中的烯鍵氫的相關(guān)性。因?yàn)榘被挠H核性大于羥基，丙烯酰反應(yīng)保留了蟲(chóng)草素的糖原部分，丙烯酰反應(yīng)選擇性發(fā)生在蟲(chóng)草素中的氨基部分。綜上幾種核磁譜圖和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合生成產(chǎn)物的Rf值、熔點(diǎn)等理化參數(shù)，也進(jìn)一步印證了蟲(chóng)草素連接上丙烯酰鍵[6]。
3-氨基丙基三乙氧基硅烷與N-丙烯酰蟲(chóng)草素中烯烴發(fā)生了aza-Michael反應(yīng)，核磁共振氫譜中（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.41 （1H，s，2-H），8.19（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.705（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.53（1H，m，4`-H），3.92（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.67（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），3.34 （m，2H，CH2），2.71（m，2H，CH2），2.64（m，2H，CH2），2.36（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.065（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），1.63（m，8H，4×CH2），0.65（m，9H，3×CH3）。核磁共振碳譜（CD3OD-d4，75 MHz），δ：173.7（C-2``），152.4（C-2），151.8（C-6），149.8（C-4），140.3（C-8），123.5（C-5），99.3（C-1`），82.4（C-4`），74.8（C-2`），63.8（C-5`），58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），34.5（C-3`），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2）。高分辨質(zhì)譜，m/z：527.256 9[M+H]+，計(jì)算值：526.257 1[14]。N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰消失，新增加了 δ：3.34（CH2），2.71（CH2），2.64（CH2），1.63（4×CH2），0.65（3×CH3）峰，以及核磁共振碳譜中134.0（C-3``），127.7（C-4``） 峰消失，新出現(xiàn) δ：58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2），N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜和核磁共振碳譜發(fā)生變化，對(duì)比N-丙烯酰蟲(chóng)草素的核磁共振氫譜和核磁共振碳譜、高分辨質(zhì)譜、Rf值，表明3-氨基丙基三乙氧基硅烷與N-丙烯酰蟲(chóng)草素完成了反應(yīng)，生成了N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲(chóng)草素。借鑒這個(gè)模板反應(yīng)，利用aza-Michael反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)行表面含有氨基的磁性材料的修飾，通過(guò)茚三酮比色法、x射線粉末衍射、磁滯回線對(duì)比追蹤了雜化反應(yīng)進(jìn)程。
按《中國(guó)藥典》方法配制茚三酮溶液（2 g茚三酮，溶于100 mL乙醇即得）[15]，F(xiàn)e3O4-NH2中氨基的茚三酮反應(yīng)中是紫色，發(fā)生了aza-Michael反應(yīng)，反應(yīng)完全后紫色消失。Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素x射線粉末衍射圖譜見(jiàn)圖3。
圖3 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素x射線粉末衍射圖譜Fig.3 X-ray powder diffraction patterns of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin
由圖3所示，N-丙烯酰蟲(chóng)草素和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素衍射峰的變化。衍射峰的位置Theta 30°～60°有衍射峰，與磁鐵礦（Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS 89-4319） 的位置是一致的，Theta 15°～30°寬峰表明了顆粒的雜化中的有機(jī)化合物的存在。
雜化前Fe3O4-NH2磁飽和率為80.0 emu/g，雜化后Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素變?yōu)?0.0 emu/g，雜化前后磁飽和率的差異顯示蟲(chóng)草素被修飾了，見(jiàn)圖4。
圖4 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素磁滯回線Fig.4 Magnetic moments of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin
蟲(chóng)草素、N-丙烯酰蟲(chóng)草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）分別為 16、1.6、3.2 μg/mL。蟲(chóng)草素、N-丙烯酰蟲(chóng)草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲(chóng)草素抗菌生理活性的差異，意味著蟲(chóng)草素修飾后氨基是穩(wěn)定的[16]。
3 結(jié)論
用反應(yīng)位點(diǎn)多的丙烯?；鶎?duì)蟲(chóng)草素中的氨基進(jìn)行了N-丙烯?；揎?，并結(jié)構(gòu)確認(rèn)，新合成出的N-丙烯酰蟲(chóng)草素，能100%與3-氨基丙基三乙氧基硅烷發(fā)生aza-Michael反應(yīng)，生成N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲(chóng)草素。借鑒這個(gè)思路，用N-丙烯酰蟲(chóng)草素進(jìn)行了水熱法合成的Fe3O4-NH2的表面修飾。蟲(chóng)草素經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后，可以達(dá)到延緩蟲(chóng)草素體內(nèi)代謝速度的目的。蟲(chóng)草素改變成丙烯酰后，其抗菌活性和蟲(chóng)草素相比，其對(duì)枯草桿菌的MIC降低了近10倍，是一個(gè)值得進(jìn)一步深入研究和有潛在開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的新化合物，藥物作用機(jī)制等問(wèn)題還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究和確證。
本文將生物、有機(jī)合成、有機(jī)無(wú)機(jī)雜化以及藥物化學(xué)理論應(yīng)用于天然藥物活性成分的研究開(kāi)發(fā)中，全面提升天然藥物活性成分的生產(chǎn)水平，大力降低其生產(chǎn)成本，并以天然活性成分為先導(dǎo)化合物、通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的手段研究開(kāi)發(fā)具有更高藥理活性的新型藥物，對(duì)其它天然藥物的研究和開(kāi)發(fā)具有方法學(xué)上的指導(dǎo)意義和借鑒作用。
