松籽油的干式酶法提取工藝優(yōu)化與理化性質(zhì)分析

祖述沖

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

紅松(PinuskoraiensisSivb.ct Zucc)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物，主要的分布范圍是中國(guó)小興安嶺及長(zhǎng)白山地區(qū)，紅松籽是紅松成熟種子去皮后得到的種仁[1]。紅松籽含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，含油脂60%～69%、蛋白質(zhì)13%～20%，還有多種維生素及生理活性物質(zhì)等[2]。松籽油中含不飽和脂肪酸高達(dá)90%[3]，包括亞麻酸、亞油酸、二十碳五烯酸、花生四烯酸及一種獨(dú)特的脂肪酸—皮諾斂酸，松籽油含有14%～19%的皮諾斂酸[4],對(duì)于治療便秘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定療效，同時(shí)具有降低血脂[5～7]、抑制食欲的功效[8～10]，近一步達(dá)到減肥效果[11]。松籽油也富含n-3/n-6多不飽和脂肪酸亞麻酸以及多種脂溶性的抗氧化成分[12]。

目前，關(guān)于松籽油的提取，多用溶劑法[13]、壓榨法[14～15]、新型的水酶法[16～17]等。但以上方法均存在諸多缺陷，溶劑法存在溶劑殘留，對(duì)于食用來(lái)說(shuō)，存在較大缺陷。壓榨法避免了使用溶劑，但是出油率低，剩余籽粕中殘油率很高，存在原材料浪費(fèi)。水酶法作用條件溫和，不使用有機(jī)溶劑，更加環(huán)保經(jīng)濟(jì)，但水酶法仍有一個(gè)問(wèn)題，用水量較高導(dǎo)致后期油水分離操作復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)采用的干式酶解法，是用極少量的水去溶解酶，然后利用酶解的方法提取松籽油，且本方法具備水酶法的全部?jī)?yōu)勢(shì)，不僅操作簡(jiǎn)便安全而且油品質(zhì)較高，同時(shí)由于用水量極低，離心處理便可得到具有松籽清香味的松籽油。同時(shí)，利用單因素法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以獲得品質(zhì)好、得率高的提取條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

脫皮紅松籽仁采自長(zhǎng)白山地區(qū)，恒溫4℃保存；固體酶制劑：中性蛋白酶(100 U·mg-1)、堿性蛋白酶(200 U·mg-1)、纖維素酶(400 U·mg-1)、α-淀粉酶(40.0～60.0 U·mg-1)、果膠酶(BR，500 U·mg-1)、半纖維素酶(20 000 U·mg-1)和糖苷酶(10萬(wàn)U·mg-1)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；正己烷為T(mén)hermo Fisher Scientific(HPLC級(jí))；石油醚、乙醇、乙酸乙酯等購(gòu)自Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co.(分析純)；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

螺旋壓榨機(jī)為六木榨油機(jī)廠SG30-2DS型榨油機(jī)；長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司GL21M高速離心機(jī)；7890A-5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；DENVER型電子分析天平；DRHH-JB6電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

揀選成熟、飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的紅松籽油籽脫殼后粉碎，粉碎過(guò)程中應(yīng)避免高速摩擦生熱影響紅松籽油品質(zhì)。將紅松種仁粉置于60℃的烘箱內(nèi)過(guò)夜干燥，干燥的紅松種仁粉過(guò)篩并分裝于密封袋內(nèi)，密封保存在4℃冰箱中以便取用。取用時(shí)應(yīng)將密封袋取出冰箱放置一段時(shí)間，待種仁粉達(dá)到室溫后再開(kāi)袋進(jìn)行稱(chēng)量，避免種仁粉吸潮。

1.2.2 不同松籽油提取工藝對(duì)比

1.2.2.1 干式酶解法提取

稱(chēng)取一定量脫殼紅松種仁粉于燒瓶中，取一定量的酶并用少量水溶解后加入燒瓶中，一定溫度下水浴加熱，酶解一定時(shí)間后，離心取上層液體，即得松籽油，計(jì)算出油率，離心底層為剩余的籽粕，測(cè)殘油率。同時(shí)不加酶作為對(duì)照組，每組試驗(yàn)重復(fù)4次并計(jì)算平均出油率、殘油率。公式如下：

出油率(%)=(實(shí)際出油量/原料重量)×100%

(1)

殘油率(%)=(實(shí)際殘油量/原料重量)×100%

(2)

1.2.2.2 壓榨提取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量脫殼紅松籽種仁置于榨油機(jī)中，設(shè)置溫度為110℃，壓榨2次，得到毛油與籽粕。將毛油進(jìn)行離心，取上清，即得松籽油，計(jì)算出油率，根據(jù)剩余的籽粕，測(cè)殘油率。每組試驗(yàn)重復(fù)4次并計(jì)算平均出油率、殘油率，公式同上。

1.2.3 提取酶的選擇

1.2.4 干式酶法松籽油提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

在本研究中，采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化紅松種仁粉的干式酶法提取工藝，以出油率作為篩選最優(yōu)提取條件的主要標(biāo)準(zhǔn)。選取以下4個(gè)因素：酶的用量、料液比、酶解溫度和酶解時(shí)間。其中各因素的變量范圍如表1所示。

表1 紅松種仁粉的干式酶法提取變量范圍

Table 1 Variable enzyme extraction range of Pinus koraiensis kernel powder

提取條件Extraction conditions變量范圍Variable range酶的用量Amount of enzyme0.050.10.150.20.250.30.4料液比Material-liquid ratio1∶12∶13∶14∶15∶16∶17∶1酶解溫度Enzymatic hydrolysis temperature(℃)30354045505560酶解時(shí)間Enzymatic hydrolysis time(h)124681012

1.2.4.1 酶用量的選擇

按照1.2.2.1中干式酶解法提取松籽油的方法，取定量脫殼紅松種仁粉，料液比為4∶1、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為6 h，設(shè)置淀粉酶用量工藝條件梯級(jí)為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.4%，通過(guò)計(jì)算松籽油出油率為指標(biāo)，考察不同酶用量對(duì)紅松種仁粉的提取效果。

1.2.4.2 料液比的選擇

按照1.2.2.1中干式酶解法提取松籽油的方法，取定量脫殼紅松種仁粉，使用上述實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)淀粉酶用量條件，其余酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為6 h，設(shè)置料液比工藝條件梯級(jí)為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1，通過(guò)計(jì)算松籽油出油率為指標(biāo)，考察不同料液比對(duì)紅松種仁粉的提取效果。

1.2.4.3 酶解溫度的選擇

讀了以上的話，我們會(huì)產(chǎn)生許多感想和聯(lián)想。請(qǐng)你以“寫(xiě)給2035年”為副標(biāo)題作文，選好角度，確定立意，自擬標(biāo)題。

按照1.2.2.1中干式酶解法提取松籽油的方法，取定量脫殼紅松種仁粉，使用上述實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)的淀粉酶用量條件以及料液比條件，其余酶解時(shí)間為6 h，設(shè)置酶解溫度工藝條件梯級(jí)為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，通過(guò)計(jì)算松籽油出油率為指標(biāo)，考察不同酶解溫度對(duì)紅松種仁粉的提取效果。

1.2.4.4 酶解時(shí)間的選擇

按照1.2.2中干式酶解法提取松籽油的方法，取定量脫殼紅松種仁粉，使用上述實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)的淀粉酶用量條件、料液比條件以及酶解溫度，設(shè)置酶解時(shí)間工藝條件梯級(jí)為1、2、4、6、8、10 h，通過(guò)計(jì)算松籽油出油率為指標(biāo)，考察不同酶解時(shí)間對(duì)紅松種仁粉的提取效果。

1.3 干式酶法松籽油理化性質(zhì)分析

1.3.1 組成成分檢測(cè)

采用GC-MS對(duì)提取的松籽油進(jìn)行組成成分分析。本文采用酸催化法對(duì)松籽油進(jìn)行甲酯化后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，吸取樣品100 μL加入到50 mL容量瓶中，向其中依次加入10 mL正己烷和2% H2SO4甲醇溶液，搖勻3 min，于60℃水浴加熱30 min，然后再加10 mL蒸餾水，搖勻2 min，等分層清晰后取上清液定容至25 mL再稀釋10倍過(guò)濾后作為色譜分析試樣。

GC檢測(cè)條件:HP-5MS型石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫150～240℃，以5 ℃/min程序升溫；進(jìn)樣口溫度250℃；柱前壓13.332 psi；進(jìn)樣量0.1 μL；載氣為高純氦氣。MS條件:電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍35～450 amu；采用wiley7n.1譜庫(kù)檢索。

1.3.2 過(guò)氧化值檢測(cè)

過(guò)氧化值檢測(cè)方法：過(guò)氧化值的測(cè)定參照GB/T 5538-2005/ISO 3960執(zhí)行。

1.3.3 酸價(jià)檢測(cè)

酸價(jià)測(cè)定參照GB/T 5530-2005執(zhí)行。

1.3.4 丙二醛檢測(cè)

丙二醛檢測(cè)主要參照GB/T5009.181-2003國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法執(zhí)行。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取酶的選擇結(jié)果

不同酶種類(lèi)對(duì)紅松種仁粉的提取效果的影響見(jiàn)圖1。由圖可知不同的酶對(duì)紅松種仁粉的提取效果不同。與空白相比，各酶均表現(xiàn)出更高的出油率，其中淀粉酶對(duì)紅松籽油的影響最大，且淀粉酶價(jià)格低廉，更適用于大規(guī)模生產(chǎn)。所以我們選擇淀粉酶作為提取酶，并進(jìn)行以下所有的條件優(yōu)化。

圖1 不同酶種類(lèi)對(duì)紅松種仁粉提取的影響Fig.1 Effects of different enzyme types on the extraction of Korean pine seed kernel powder

2.2 干式酶法松籽油提取工藝單因素優(yōu)化

2.2.1 酶用量的影響

隨著酶用量的增加，出油率呈現(xiàn)先增后降再增加的趨勢(shì)，在0.2%時(shí)達(dá)到最大。酶用量在0.4%時(shí)出油率與0.2%相同。由于過(guò)多的酶會(huì)使油的品質(zhì)下降，以及酶用量的增加也會(huì)加大成本，所以選擇0.2%為最佳的酶用量，并用來(lái)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 不同酶對(duì)紅松種仁粉提取的影響Fig.2 Effects of different enzymes on the extraction of Korean pine seed kernel powder

圖3 不同料液比對(duì)紅松種仁粉提取的影響Fig.3 Effect of different material-liquid ratios on extraction of Korean pine seed kernel powder

圖4 不同酶解溫度對(duì)紅松種仁粉提取的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on extraction of Korean pine seed kernel powder

圖5 不同酶解時(shí)間對(duì)紅松種仁粉提取的影響Fig.5 Effect of different enzymolysis time on extraction of Korean pine seed kernel powder

2.2.2 料液比的影響

以0.2%淀粉酶用量為最優(yōu)條件，料液比在1∶1～6∶1，出油率與料液比成正相關(guān)，在料液比為6∶1時(shí)，出油率達(dá)到了最大。隨之，伴著料液比的增大，出油率開(kāi)始減小。這可能是因?yàn)樵诹弦罕容^低的時(shí)候，酶分子與底物不能完全結(jié)合，隨著濃度增加結(jié)合的酶分子越來(lái)越多，直到底物飽和。隨后繼續(xù)增加底物濃度，但反應(yīng)速度不再提高，且會(huì)因?yàn)闈舛忍叨鴾p少酶與底物結(jié)合的幾率，降低反應(yīng)速度，所以選擇6∶1為最佳的料液比，并用來(lái)進(jìn)行下面的優(yōu)化(圖3)。

2.1.4 酶解溫度的影響

以0.2%淀粉酶和料液比6∶1的最優(yōu)條件，紅松種仁粉的出油率隨著酶解溫度的升高而增加，在55℃時(shí)達(dá)到峰值，然后隨著酶解溫度的升高反而減少。原因可能是在本實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，淀粉酶的最適溫度在55℃附近，且在該溫度下活性最大，所以酶解效率最高，出油率也最高。故而選擇55℃作為最優(yōu)條件進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)(圖4)。

2.1.5 酶解時(shí)間的影響

在0.2%淀粉酶、料液比6∶1和酶解溫度為55℃的最優(yōu)條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，在1～8 h內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，出油率也逐漸升高，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，酶可能失活或者底物濃度降低，是的出油率不再升高，所以選擇8 h作為最佳酶解時(shí)間(圖5)。

2.2 干式酶法提取松籽油理化性質(zhì)分析

2.2.1 組成成分檢測(cè)

松籽油進(jìn)行甲酯化處理后采用GC-MS對(duì)其主要成分進(jìn)行分析，結(jié)合人工圖譜解析，在相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上確定了松籽油中主要飽和、不飽和脂肪酸組成成分及其相對(duì)含量(表2，圖6)。

圖6 松籽油混合脂肪酸氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of mixed fatty acids in pine seed oil

表2 氣質(zhì)聯(lián)用分析松籽油主要成分及相對(duì)含量

Table 2 Composition and relative content of the pine seed oil by GC-MS analysis

脂肪酸成分Fatty acid composition分子式Molecular formula分子量Molecular weight松籽油Pine seed oil介酸Mediation acidC10H9NO4S239.252.41%棕櫚酸Palmitic acidC16H32O2256.426.5%皮諾斂酸Pinolenic acidC18H30O2278.4314.59%亞油酸Linoleic acidC18H32O2280.4446.25%油酸Oleic acidC18H34O2282.4726.84%硬脂酸Stearic acidC18H36O2284.483.41%

經(jīng)檢測(cè)干式酶法提取的松籽油不飽和脂肪酸的含量為90.09%，其中油酸含量為26.84%，介酸含量為2.41%、亞油酸含量為46.25%、皮諾斂酸為14.59%；飽和脂肪酸中棕櫚酸含量為6.5%、硬脂酸為3.41%。不飽和脂肪酸的含量為90.36%，其中亞麻酸含量為40.71%、亞油酸含量為27.25%、油酸含量為22.40%；飽和脂肪酸中棕櫚酸含量為7.23%、硬脂酸為1.60%。經(jīng)檢測(cè)各組分含量均符合《中華人民共和國(guó)糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 3242-2014》松籽油中相應(yīng)組分含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與分析

經(jīng)檢測(cè)干式酶解法提取的松籽油各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(表3)。

表3 松籽油的過(guò)氧化值

3 結(jié)論

利用一種干式酶法的提取工藝對(duì)紅松籽油進(jìn)行提取，與常規(guī)壓榨法相比，表現(xiàn)出較高的出油率。再利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)干式酶法提取松籽油提取工藝的條件進(jìn)行優(yōu)化，以及對(duì)最優(yōu)條件下制備的松籽油進(jìn)行理化性質(zhì)表征。結(jié)果表明，最優(yōu)的干式酶法提取松籽油制備工藝為：0.2%淀粉酶、料液比為6∶1，在55℃條件下，酶解8 h，所得最大出油率為90.2%，殘油率為6.2%。經(jīng)檢測(cè)最佳制備條件提取的松籽油中不飽和脂肪酸的含量為90.09%，其中油酸含量為26.84%，介酸含量為2.41%、亞油酸含量為46.25%、皮諾斂酸為14.59%；飽和脂肪酸中棕櫚酸含量為6.5%、硬脂酸為3.41%。松籽油酸價(jià)為2.27 mg·g-1、過(guò)氧化值為1.71 mmol·kg-1、丙二醛含量為0.41 mg·kg-1。所有檢測(cè)結(jié)果均高于《中華人民共和國(guó)糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 3242-2014》松籽油中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。與其他工藝相比，干式酶解法提取松籽油不僅工藝簡(jiǎn)單、出油率高，而且損耗以及殘油率很低，在有效的保證松籽油中營(yíng)養(yǎng)成分及伴隨物不被破壞的同時(shí)且各理化指標(biāo)均優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，這為進(jìn)一步高效提取松籽油工藝奠定了基礎(chǔ)。