細(xì)葉百合LpPEX7基因克隆及鹽脅迫下的表達(dá)特性分析

何 好 朱國(guó)慶 陳詩(shī)雅 徐 暢 金淑梅

(東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

過(guò)氧化物酶體含有豐富的各種酶類，如氧化酶、過(guò)氧化物酶等，參與活性氧的生成與降解，毒性物質(zhì)的清除，對(duì)保護(hù)細(xì)胞起了重要作用[1～2]。過(guò)氧化物酶體生物合成酶(PEX)是一系列參與過(guò)氧化物酶體合成的蛋白，是過(guò)氧化物酶體在生物體內(nèi)合成的關(guān)鍵酶，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三十多種PEX蛋白[3]，PEX蛋白在植物體提高抗逆能力中起重要作用[4～6]。

構(gòu)成過(guò)氧化物酶體的蛋白質(zhì)有兩類:膜蛋白(peroxisomal membrane protein，PMP)和基質(zhì)蛋白[7]。膜蛋白和基質(zhì)蛋白正確組裝，形成了成熟的過(guò)氧化物酶體。基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)是由其本身肽鏈上的定位信號(hào)(peroxisomal targeting signal，PTS)來(lái)完成的[8]。PTS有PTS1和PTS2兩種[9]。PTS1是C-末端過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)類型1，PTS2是N-末端過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)類型2[10～11]。PEX7是PTS2的受體，由PEX7基因編碼，是形成過(guò)氧化物酶體的關(guān)鍵蛋白[12～14]。在PEX7突變體中不僅觀察到PTS2蛋白質(zhì)運(yùn)輸進(jìn)入過(guò)氧化物酶體的缺陷，而且還觀察到了PTS1運(yùn)輸進(jìn)入過(guò)氧化物酶體的缺陷[15～16]。

胡楊PePEX11能夠提高擬南芥在鹽脅迫下的抗氧化能力，提升耐鹽能力[5]。超表達(dá)擬南芥PEX11基因可促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增殖，而RNAi植株則會(huì)減少氧化物酶體數(shù)量[17]。缺失PEX11基因會(huì)降低過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)，從而降低對(duì)逆境脅迫的抵抗能力[18]。過(guò)表達(dá)臘梅CpPEX22基因的煙草在受到H2O2脅迫后，CAT、SOD、POD活性和MDA含量都比未轉(zhuǎn)基因的煙草中有所提高[6]。雖然已知過(guò)氧化物酶體是保護(hù)細(xì)胞、增強(qiáng)植物對(duì)鹽堿耐受性的重要細(xì)胞器，PEX7蛋白是合成過(guò)氧化物酶體的關(guān)鍵蛋白，但PEX7蛋白是否在鹽堿或氧化逆境中發(fā)生一定的功能未見(jiàn)研究報(bào)道，PEX7基因是否也如同PEX11以及PEX22基因一樣，與鹽堿或氧化逆境有一定的應(yīng)答關(guān)系，是本研究要解決的主要問(wèn)題。

我們對(duì)20 mmol·L-1NaHCO3處理后的細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，LpPEX7基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，本研究克隆出LpPEX7基因的開(kāi)放閱讀框，對(duì)LpPEX7的生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，在H2O2，NaCl或NaHCO3逆境脅迫條件下，對(duì)LpPEX7基因表達(dá)量進(jìn)行了研究，LpPEX7基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，提高了擬南芥的抗鹽堿和抗氧化的能力，為詳細(xì)研究該基因的抗鹽堿功能奠定理論和材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

植物材料為組織培養(yǎng)的細(xì)葉百合，ES-Taq DNA Polymerase、RT-PCR試劑盒、PMD-18T載體、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Takara公司，UltraSYBR Mixture試劑，膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，試驗(yàn)所需菌株大腸桿菌DH5α和EH105來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 LpPEX7基因開(kāi)放閱讀框的克隆

通過(guò)分析細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物(上游為L(zhǎng)pPEX7F：5′-CGCACCATGCCAGTCTT-3′,下游為L(zhǎng)pPEX7R：5′-CAAGTATCAGGCCACTGC-3′)，采用CTAB法[19]提取細(xì)葉百合的總RNA，使用Reverse transcription-PCR試劑盒對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得細(xì)葉百合cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)充延伸10 min。電泳檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將回收片段連接到PMD-18T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆搖菌，PCR鑒定后，菌液送公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用在線工具ProtParam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、SignalP-5.0 Server分析預(yù)測(cè)存在信號(hào)肽的概率、TMHMM Server v.2.0分析預(yù)測(cè)LpPEX7有無(wú)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)、PSIPRED V4.0預(yù)測(cè)LpPEX7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL分析LpPEX7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)、SMART:Main page分析LpPEX7的保守結(jié)構(gòu)域、MEME分析motif。將克隆基因測(cè)序得到的結(jié)果在NCBI中進(jìn)行blast分析，找出相似度較高的其他物種PEX7的氨基酸序列，利用DNA Man軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)同源氨基酸序列比對(duì)，使用MEGA3.1構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，觀察細(xì)葉百合PEX7與其他物種PEX7的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

1.4 LpPEX7基因在細(xì)葉百合不同器官中的表達(dá)特性

分別提取細(xì)葉百合根、鱗莖、葉、花、種子的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)LpPEX7基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(上游為qPCRLpPEX7F:5′-TCCGAGTCTCACGAGTCCAT-3′，下游為qPCRLpPEX7R:5′-CAGTAGGCATGCTCCCGAAA-3′)。利用UltraSYBR Mixture試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL(2×SYBR Green Mix 10 μL；10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL；cDNA模板1 μL；ddH2O 8 μL)；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。得到細(xì)葉百合不同器官中LpPEX7基因的表達(dá)量并進(jìn)行分析。

1.5 LpPEX7基因在逆境處理后的細(xì)葉百合葉和鱗莖中的表達(dá)特性

將組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)一致的細(xì)葉百合植株移入到MS培養(yǎng)基(CK)和分別添加200 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1NaHCO3，11 mmol·L-1H2O2的MS培養(yǎng)基中，不同脅迫處理6、12、24，36、48 h后，提取葉和鱗莖的RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用1.4設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行qRT-PCR，分析LpPEX7基因在脅迫處理后的細(xì)葉百合葉和鱗莖中的表達(dá)情況。

1.6 LpPEX7基因過(guò)表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)抗鹽堿表型分析

根據(jù)1.2測(cè)序得到的序列結(jié)果，設(shè)計(jì)添加帶限制性內(nèi)切酶的引物(上游為：pPEX7BamHⅠF5′-GGATCCATGCCAGTCTTCAAAAC-3′,下游為：pPEX7SalⅠR5′-GTCGACTCAGGCCACTGCTCTG-3′引物中帶下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ的序列)，LpPEX7連接到pMD18-T載體上的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳并回收目的條帶，連接到pMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。轉(zhuǎn)化后的菌液提取的質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收酶切后的基因和載體片段，利用T4連接酶22℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，KaNa青霉素篩選陽(yáng)性克隆，酶切鑒定正確后，用電擊法將pBI121-LpPEX7質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花浸法[20]將攜帶pBI121-LpPEX7外源基因的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中。收獲的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子消毒后鋪在含有KaNa的1/2MS篩選培養(yǎng)基上萌發(fā)，篩選出的能正常生長(zhǎng)的綠色植株連續(xù)自交2代得到T3代純合種子，利用試劑盒提取生長(zhǎng)兩周的T3代種子萌發(fā)后的幼苗葉片RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)8株過(guò)表達(dá)LpPEX7的擬南芥株系中的LpPEX7基因表達(dá)量，qRT-PCR方法同1.4。

含有1/2MS和分別添加H2O2(2，3 mmol·L-1)、NaCl(125，150 mmol·L-1)和NaHCO3(3，5 mmol·L-1)的1/2MS培養(yǎng)基的圓形玻璃平板均分4個(gè)扇形結(jié)構(gòu)，野生型擬南芥和T3代過(guò)表達(dá)LpPEX7基因的擬南芥株系#1、#2、#3的種子播種在4個(gè)扇形區(qū)域，每個(gè)區(qū)域14粒種子。播種后的平板于4℃春化48 h，轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)中，10 d后觀察在不同脅迫處理下野生型和過(guò)表達(dá)LpPEX7基因的擬南芥株系的種子萌發(fā)狀況并拍照，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LpPEX7基因開(kāi)放閱讀框的克隆

以細(xì)葉百合cDNA為模板，以LpPEX7F，LpPEX7R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，大小約為1 000 bp的位置有PCR產(chǎn)物條帶(圖1)。將條帶回收后與pMD-18T載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑取單克隆菌落搖菌后進(jìn)行PCR檢測(cè)，將檢測(cè)條帶位置正確的菌液提取質(zhì)粒送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為957 bp。

圖1 LpPEX7-T PCR檢測(cè)Fig.1 LpPEX7-T PCR assay M.DL5000 marker；1.LpPEX7-T

2.2 生物信息學(xué)分析

ProtParam軟件在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：分子式為C1594H2402N436O464S11、相對(duì)分子質(zhì)量為35 449.91 Da、等電點(diǎn)為5.46、不穩(wěn)定系數(shù)為40.24、總平均親水性為-0.108。通過(guò)在線分析工具SignalP-5.0 Server：分析預(yù)測(cè)存在信號(hào)肽的概率為0.001 1，TMHMM Server v.2.0分析預(yù)測(cè)無(wú)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)。在線分析工具PSIPRED V4.0預(yù)測(cè)LpPEX7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，存在許多股和卷曲結(jié)構(gòu)(圖2A)，SWISS-MODEL在線軟件分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符合(圖2B)。SMART軟件分析LpPEX7的保守結(jié)構(gòu)域，存在6個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域、1個(gè)PQQ結(jié)構(gòu)域和1個(gè)6PGD結(jié)構(gòu)域。6個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域位置分別在50～89、95～135、138～178、181～221、225～265和269～309氨基酸處(圖2C)，而PQQ和6PGD結(jié)構(gòu)域在16～56、40～201氨基酸處。

圖2 LpPEX7結(jié)構(gòu)分析 A.LpPEX7二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B.LpPEX7三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C.LpPEX7保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Structural analysis of LpPEX7 A.Prediction for the secondary structure of LpPEX7; B.Prediction for the tertiary structure of LpPEX7; C.Prediction of the conserved domains of LpPEX7

圖3 LpPEX7與其他植物同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of LpPEX7 with other plant homologous proteins

圖4 細(xì)葉百合LpPEX7與其他植物PEX7蛋白序列MEME聚類分析Fig.4 MEME cluster analysis of LpPEX7 with other plant PEX7 proteins

利用DNA Man軟件將細(xì)葉百合LpPEX7和其他物種PEX7的氨基酸序列(海棗PhoenixdactyliferaXP_008813497.1，83.96%；鐵皮石斛DendrobiumcatenatumXP_020705736.1，82.7%；深圳擬蘭ApostasiashenzhenicaPKA46872.1，83.02%；油棕ElaeisguineensisXP_010925636.1，83.33%；姬蝴蝶蘭PhalaenopsisequestrisXP_020576756.1，80.82%；菜豆PhaseolusvulgarisXP_009404509.1，76.18%；赤豆VignaangularisXP_017436924.1，76.18%)進(jìn)行對(duì)比(圖3)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列與其他植物的PEX7具有較高的同源性以及相似的保守區(qū)，認(rèn)為從細(xì)葉百合cDNA中克隆出來(lái)的基因?yàn)镻EX7，命名為L(zhǎng)pPEX7，NCBI登錄號(hào)為MN380029。利用MEME在線軟件分析細(xì)葉百合LpPEX7與其他植物PEX7蛋白序列排名前三的motif(圖4)，細(xì)葉百合LpPEX7基序a位置在1～50氨基酸處、基序b和c主要分布在WD40保守區(qū)域。

利用MEGA3.1構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)后發(fā)現(xiàn)，LpPEX7蛋白與海棗、鐵皮石斛、深圳擬蘭、油棕、姬蝴蝶蘭等植物的PEX7親緣關(guān)系較近(圖5)。

2.3 LpPEX7基因在細(xì)葉百合不同器官中的表達(dá)特性

運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)LpPEX7基因在細(xì)葉百合不同器官的表達(dá)特異性，3組重復(fù)的表達(dá)差異較小，數(shù)據(jù)可靠。本研究中LpPEX7基因在細(xì)葉百合的種子中表達(dá)量最高、葉片和鱗莖中表達(dá)量較高(圖6)。

2.4 LpPEX7基因在逆境處理后的細(xì)葉百合葉片和鱗莖中的表達(dá)特性

為了分析LpPEX7基因與鹽堿逆境的關(guān)系，選取了200 mmol·L-1NaCl、20 mmol·L-1NaHCO3、11 mmol·L-1H2O2三種逆境，對(duì)細(xì)葉百合進(jìn)行不同時(shí)間梯度的逆境脅迫處理，結(jié)果顯示，LpPEX7基因受到這三種逆境的誘導(dǎo)后表達(dá)量都有所增加。不同脅迫處理后，隨著處理時(shí)間的變化，葉中LpPEX7的表達(dá)量先增加后降低，200 mmol·L-1NaCl處理12 h后葉中LpPEX7的表達(dá)量達(dá)到最大(圖7A)。20 mmol·L-1NaHCO3處理24 h后表達(dá)量達(dá)到最大(圖7B)。11 mmol·L-1H2O2處理12 h后葉中LpPEX7的表達(dá)量達(dá)到最大(圖7C)。

圖5 LpPEX7與其他植物同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of LpPEX7 and other plant homologous proteins

圖6 LpPEX7基因在細(xì)葉百合不同部位表達(dá)量Fig.6 The expression of LpPEX7 gene in different parts of Lilium pumilum

隨著200 mmol·L-1NaCl處理時(shí)間的變化，鱗莖中LpPEX7的表達(dá)量先增加，在處理12 h后達(dá)到最大(圖7D)，降低后再有少量增加。20 mmol·L-1NaHCO3脅迫處理后，隨處理時(shí)間的增加鱗莖中LpPEX7的表達(dá)量先增加然后降低，在處理24 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量(圖7E)。11 mmol·L-1H2O2脅迫處理的鱗莖中LpPEX7表達(dá)量表達(dá)量也是先增加后降低，然后再增加，在H2O2處理12 h后達(dá)到最大表達(dá)量(圖7F)。LpPEX7基因的表達(dá)量在逆境處理的24 h內(nèi)都得到了大量表達(dá)，這說(shuō)明在遇到脅迫的條件下，LpPEX7基因能立即開(kāi)始表達(dá)，參與到應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，從而增加植物的抗逆性。

2.5 LpPEX7基因過(guò)表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)抗鹽堿表型分析

為在植物中高效表達(dá)LpPEX7這個(gè)外源基因，選取了由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pBI121進(jìn)行了載體構(gòu)建，將構(gòu)建的pBI121-LpPEX7質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ/SalⅠ雙酶切，基因與載體位置正確(圖8A)，說(shuō)明pBI121-LpPEX7構(gòu)建成功。如圖8B所示，以未轉(zhuǎn)基因的擬南芥為陰性對(duì)照，利用qPCR檢測(cè)的方法，得到#1～#8轉(zhuǎn)基因的擬南芥中LpPEX7基因的表達(dá)量均比未轉(zhuǎn)基因的擬南芥中高，最高達(dá)到30倍左右，這說(shuō)明細(xì)葉百合中LpPEX7這個(gè)基因轉(zhuǎn)化擬南芥成功，并且得到了高表達(dá)。選擇LpPEX7過(guò)表達(dá)株系中LpPEX7表達(dá)量相對(duì)較高的#1、#2和#3株系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 過(guò)表達(dá)LpPEX7基因的擬南芥植株抗性分析

LpPEX7基因在細(xì)葉百合的種子中表達(dá)量最高，為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)入LpPEX7基因的擬南芥株系的種子對(duì)于鹽及氧化逆境是否具有一定的耐受性，我們選取野生型和自交3代的三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系#1、#2、#3的種子進(jìn)行了耐鹽性的初步實(shí)驗(yàn)。各個(gè)株系的種子在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右，觀察種子的萌發(fā)結(jié)果如圖9，在沒(méi)施加任何脅迫的1/2MS培養(yǎng)基中，野生型和三個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的萌發(fā)狀態(tài)幾乎一致，但是在脅迫處理的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯的區(qū)別，在2 mmol·L-1H2O2、3 mmol·L-1H2O2、125 mmol·L-1NaCl和3 mmol·L-1NaHCO3脅迫處理培養(yǎng)基中，4種株系的種子都能發(fā)芽，但野生型植株的種子萌發(fā)比過(guò)表達(dá)植株#1和#3的種子萌發(fā)晚1～3 d。在150 mmol·L-1NaCl和5 mmol·L-1NaHCO3的抗性培養(yǎng)基上，野生型幾乎不能正常萌發(fā),而轉(zhuǎn)基因株系#1和#3的多數(shù)種子可以萌發(fā)，種子發(fā)芽率比野生型的明顯好，#2過(guò)表達(dá)和野生型植株種子的萌發(fā)率差不多。

圖7 逆境脅迫下細(xì)葉百合葉片和鱗莖中LpPEX7基因的表達(dá)量 A～C.LpPEX7基因分別在200 mmol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1 NaHCO3、11 mmol·L-1 H2O2處理后細(xì)葉百合葉中的表達(dá)量；D～F.LpPEX7基因分別在200 mmol·L-1 NaCl、20 mmol·L-1 NaHCO3、11 mmol·L-1 H2O2處理后細(xì)葉百合鱗莖中的表達(dá)量Fig.7 LpPEX7 gene expression in leaves and bulbs of L.pumilum under stress A-C. The expression of LpPEX7 gene in leaves of L.pumilum after treatment with 200 mmol·L-1 NaCl,20 mmol·L-1 NaHCO3 and 11 mmol·L-1 H2O2,respectively; D-F. The expression of LpPEX7 gene in bulbs of L.pumilum after treatment with 200 mmol·L-1 NaCl,20 mmol·L-1 NaHCO3 and 11 mmol·L-1 H2O2,respectively

圖8 pBI121-LpPEX7的酶切鑒定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定LpPEX7基因的表達(dá)量 A.pBI121-LpPEX7的酶切鑒定(M. DM5000 Marker；1.pBI121-LpPEX7的雙酶切)；B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定LpPEX7基因的表達(dá)量(WT.野生型擬南芥；#1～#8.LpPEX7過(guò)表達(dá)株系)Fig.8 pBI121-LpPEX7 identified by restriction enzymes and identify the expression of LpPEX7 gene by qRT-PCR A.pBI121-LpPEX7 identified by restriction enzymes(M. DM5000 Marker; 1. pBI121-LpPEX7 digested by double enzymes); B.Identify the expression of LpPEX7 gene by qRT-PCR(WT. Wild type A.thaliana；#1-#8. LpPEX7 overexpression lines)

圖9 萌發(fā)期野生型和LpPEX7基因過(guò)表達(dá)擬南芥的抗逆性分析 WT.野生型擬南芥；#1～#3.LpPEX7過(guò)表達(dá)株系Fig.9 Resistance analysis of wild type and LpPEX7 overexpression A.thaliana on germination stage WT.Wild type A.thaliana；#1-#3.LpPEX7 overexpression lines

3 討論

PEX7蛋白作為帶有PTS2信號(hào)基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)過(guò)氧化物酶體的合成起到至關(guān)重要的作用。對(duì)PEX7突變體的研究發(fā)現(xiàn)，PEX7蛋白的缺失，不僅PTS2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)異常，PEX5和PEX7相互作用，致使PTS1蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)也發(fā)生異常[15,21]。由此看來(lái)，LpPEX7蛋白對(duì)于過(guò)氧化物酶體的形成起著至關(guān)重要的作用，過(guò)氧化物酶體是一種亞細(xì)胞器，富含各種酶類，參與活性氧的生成與降解，毒性物質(zhì)的清除，其數(shù)量的增多，可以提高植物對(duì)活性氧毒害的耐受性，進(jìn)而提高植物的抗逆性，因此對(duì)LpPEX7基因的表達(dá)性質(zhì)進(jìn)行研究，對(duì)研究植物的耐鹽堿能力具有重要作用。

通過(guò)對(duì)NaHCO3處理后的細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)LpPEX7基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，我們從細(xì)葉百合鱗莖中克隆得到這個(gè)基因的ORF區(qū)，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因與其他植物的PEX7相似度很高，同源序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析確定這個(gè)基因是PEX7。

在LpPEX7基因編碼的氨基酸中存在著與海棗、鐵皮石斛、油棕等Pex7蛋白相同的WD-40蛋白重復(fù)序列特征，WD-40結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，并能與其他蛋白互作，形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控下游的反應(yīng)[22]，因此推測(cè)，在鹽堿脅迫條件下，LpPEX7可能與其他調(diào)控鹽堿逆境的蛋白相互作用，或者調(diào)控下游基因的反應(yīng)來(lái)提高植物的抗逆性。G6PD結(jié)構(gòu)域?qū)儆?-磷酸葡萄糖酸脫氫酶典型結(jié)構(gòu)域，能參與多種非生物脅迫[23]，LpPEX7蛋白具有一個(gè)G6PD結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可能使LpPEX7蛋白在參與多種非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用。PQQ(Pyrroloquinoline quinone，吡咯喹啉醌)是一種氧化還原酶的輔酶，PQQ對(duì)自由基有清除作用，可以保護(hù)機(jī)體減少氧化損傷[24]。LpPEX7的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，LpPEX7含有一個(gè)PQQ結(jié)構(gòu)域，由于鹽堿逆境能產(chǎn)生大量的氧自由基(活性氧)，本研究進(jìn)行了未轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因的擬南芥株系種子在H2O2逆境脅迫下的萌發(fā)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，過(guò)表達(dá)LpPEX7基因的擬南芥在逆境條件下能夠提高種子的萌發(fā)效果，或許就是通過(guò)清除逆境所產(chǎn)生的大量自由氧基的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

海棗的PEX7是從海棗線粒體轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的[25]，鐵皮石斛Pex7與花發(fā)育及適應(yīng)性進(jìn)化有關(guān)[26]，油棕Pex7蛋白在果實(shí)后熟過(guò)程中表達(dá)豐富[27]，菜豆Pex7與種子中的高淀粉和低脂肪有關(guān)[28]。蛋白質(zhì)同源序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)LpPEX7與這些物種的PEX7比較接近，本研究中LpPEX7基因在花和種子中均有表達(dá)，并且在細(xì)葉百合的種子中表達(dá)量最大，這說(shuō)明LpPEX7基因除了能在提高植物逆境方面起作用外，可能在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也起到重要作用。

用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)葉百合不同器官中LpPEX7的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在種子、葉片和鱗莖中表達(dá)量高，在根和花中的表達(dá)量比較低。從LpPEX7基因在脅迫處理后的細(xì)葉百合葉片和鱗莖中表達(dá)量來(lái)看，LpPEX7基因在H2O2，NaCl或NaHCO3脅迫處理12或24 h的表達(dá)量最高，說(shuō)明在植物受到逆境脅迫后，LpPEX7立刻啟動(dòng)表達(dá)程序來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境的改變。PEX7是過(guò)氧化物酶體生物合成的關(guān)鍵酶，提高LpPEX7的表達(dá)量，也許過(guò)氧化物酶體合成的數(shù)量有所增加，進(jìn)而提高植物的抗逆能力。

LpPEX7在不同細(xì)葉百合器官中的表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，LpPEX7基因在種子中表達(dá)量高，因此我們做了種子萌發(fā)期植物抗逆性的研究。利用農(nóng)桿菌侵染的方法將LpPEX7轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過(guò)KaNa篩選和qRT-PCR鑒定出LpPEX7過(guò)表達(dá)T3代株系。在鹽堿和氧化處理下，觀察野生型、LpPEX7過(guò)表達(dá)株系擬南芥種子的萌發(fā)狀況，LpPEX7過(guò)表達(dá)擬南芥株系種子的萌發(fā)要優(yōu)于野生型種子的萌發(fā)，初步說(shuō)明LpPEX7基因過(guò)表達(dá)增加了擬南芥種子對(duì)鹽堿和氧化逆境的抗性，但LpPEX7基因在植物種子中通過(guò)什么樣的途徑來(lái)提高過(guò)表達(dá)植株種子的抗性，還有待進(jìn)一步的研究。

本研究在克隆出細(xì)葉百合LpPEX7基因及對(duì)該基因進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)研究的基礎(chǔ)上，分析了在不同器官和不同鹽堿逆境下細(xì)葉百合中的mRNA表達(dá)特性，對(duì)野生型和基因過(guò)表達(dá)擬南芥種子的抗逆性表型方面進(jìn)行觀察。為了解LpPEX7基因與鹽堿、氧化逆境的應(yīng)答關(guān)系，為細(xì)葉百合的耐鹽堿性分子機(jī)理研究提供重要的候選基因奠定基礎(chǔ)。