蘭科新種巾唇蘭的花粉團(tuán)發(fā)育及分類學(xué)意義

李 璐 張 錦,2 李楚然 王艷萍,2 譚慶琴,2 羅 艷

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224； 3.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園園林園藝部，勐臘 666303)

自19世紀(jì)初以來，花藥形態(tài)特征的多樣性在蘭科的系統(tǒng)演化中占有重要的一席之地。1810年Brown把蘭科分成了五個(gè)組(secitons)時(shí)，就參考了花粉粒的愈合程度和排列方式[1]。到1826年，Lindley建立蘭科的新屬、新種、組和族等分類階元時(shí)，花藥特征成了主要分類依據(jù)[2]。花藥發(fā)育特征的多樣性一直是蘭科分類鑒定和系統(tǒng)演化的重要依據(jù)，例如：成熟花藥的散粉方式(花粉粒、粘性花粉粒、花粉小塊、花粉團(tuán))，花粉團(tuán)數(shù)目(2，4，6或8)和形態(tài)(全緣、孔裂、深裂或淺裂)的形成機(jī)制，花藥壁發(fā)育類型，小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的胚胎學(xué)特征等[3～6]。

巾唇蘭屬(PennilabiumJ.J.Sm.)是蘭科(Orchidaceae)一類多年生附生蘭，株型矮小，葉片扁平、肉質(zhì)、叢生；總狀花序側(cè)生，由1～2朵花組成，花為白色、黃色、奶油色或橙色肉質(zhì)，唇瓣與合蕊柱基部愈合，具距，三裂，中裂片較短肉質(zhì)；側(cè)裂片大，截形或退化為耳狀，前端邊緣具不規(guī)則的齒；具2個(gè)近圓形的花粉團(tuán)[7～8]。巾唇蘭屬約有17種，全世界分布中心位于馬來西亞半島和婆羅洲[9～11]。巾唇蘭屬為中國(guó)分布的新記錄屬，研究資料較少。2004和2014年我國(guó)植物學(xué)家先后報(bào)道了巾唇蘭屬的2個(gè)種，即巾唇蘭(P.yunnanenseS.C.Chen & Y.B.Luo)[7]和鴕鳥巾唇蘭(P.struthioCarr)[11]，前者為新種，發(fā)現(xiàn)于云南南部，在印度和泰國(guó)也有分布；后者為發(fā)現(xiàn)于海南的中國(guó)新記錄，在馬來西亞半島、婆羅洲和越南也有分布[12]。

最近的分子系統(tǒng)學(xué)研究一致認(rèn)為，巾唇蘭屬為蘭科樹蘭亞科萬代蘭族指甲蘭亞族(Subfam.Epidendroideae,Trib.Vandeae,Subtrib.Aeridinae)成員和我國(guó)也有分布的管唇蘭屬(Tuberolabium)、蝦尾蘭屬(Parapteroceras)以及分布在熱帶亞洲的幾個(gè)小屬組成了一個(gè)穩(wěn)定的單系類群，即囊唇蘭近緣類群分支(Saccolabiumalliance)[13～17]。有意思的是，巾唇蘭屬建立時(shí)就是從囊唇蘭屬分離出來的，但后選模式種是由L.A.Garay指定為P.angraecum(Ridl.) J.J.Sm[18～19]。目前，關(guān)于巾唇蘭屬的研究資料比較少，需要更多的學(xué)科證據(jù)來澄清它和囊唇蘭屬的親緣關(guān)系。

巾唇蘭是附生于海拔約1 300米的茶樹樹干上的多年生小型草本，1987年在云南省景洪市發(fā)現(xiàn)后被移栽至西雙版納熱帶植物園，于2004年發(fā)表的一個(gè)巾唇蘭屬新種。正如O’Byrne所描述的那樣，巾唇蘭屬所有的種都是罕見和稀有的[20]，目前關(guān)于巾唇蘭屬的研究較少，亟待補(bǔ)充[7]。考慮到花粉團(tuán)發(fā)育的胚胎學(xué)特征在系統(tǒng)進(jìn)化、傳粉生物學(xué)以及生殖生物學(xué)方面的重要性，本文通過花形態(tài)解剖和石蠟切片技術(shù)觀察了巾唇蘭的花形態(tài)特征和花粉團(tuán)發(fā)育過程，為更好地理解巾唇蘭屬在指甲蘭亞族中親緣系統(tǒng)關(guān)系和人工繁育的保護(hù)生物學(xué)方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料栽培于西南林業(yè)大學(xué)科研教學(xué)實(shí)習(xí)基地(云南豐春坊生物科技有限公司蘭花資源圃)，正常開花。在2018年7月采集不同發(fā)育時(shí)期的花蕾和開放花，一部分新鮮材料用于解剖鏡觀察拍照，另一部分固定在FAA保存。固定后的材料經(jīng)系列酒精脫水、石蠟包埋、切片(切片厚度7 μm)、鐵釩—蘇木精染色、中性樹脂封片，烘干后用NikonE600顯微鏡觀察拍照。用圖像編輯軟件Adobe Photoshop CS6完成研究結(jié)果的圖片排版。

2 結(jié)果與分析

2.1 花形態(tài)解剖特征

巾唇蘭是多年生附生草本，莖直立，具3～4枚葉，扁平稍肉質(zhì)長(zhǎng)圓形，具宿存的鞘?？偁罨ㄐ騻?cè)生于莖的基部，具2～3朵花，花序近下垂(圖版Ⅰ：1)?；ò旰突ㄝ鄿\黃色，花瓣全緣、狹長(zhǎng)圓形，先端漸尖，形狀與萼片相似而稍小。唇瓣3裂(圖版Ⅰ：2)。合蕊柱短，無蕊柱足(圖版Ⅰ：3～6)。唇瓣貼生于蕊柱基部，無關(guān)節(jié)；側(cè)裂片大，近匙形，前端邊緣具不規(guī)則的齒(圖版Ⅰ：3)；肉質(zhì)中裂片較短，近舌形，先端銳尖，中部有兩條縱向褶皺帶紫色斑點(diǎn)(圖版Ⅰ：4～6)，距圓筒形，末端圓形(圖版Ⅰ：3～4)。在花藥帽前端可見一個(gè)狹長(zhǎng)2裂蕊喙(圖版Ⅰ：5)?；ǚ蹓K(pollinarium)由2個(gè)近球形的蠟質(zhì)花粉團(tuán)(pollinium)、粘盤柄和粘盤組成(圖版Ⅰ：7～9)。粘盤質(zhì)地較厚，橢圓形；粘盤柄從基部向上擴(kuò)大成翼形(圖版Ⅰ：9)。

2.2 巾唇蘭的花粉團(tuán)的發(fā)育

早期的花藥原基分化為一對(duì)側(cè)生并列的橢圓形花藥室，并朝唇瓣方向彎曲生長(zhǎng)，兩個(gè)藥室之間有明顯的藥隔組織相連，每個(gè)藥室有一團(tuán)染色較深的孢原細(xì)胞組成的孢子囊(圖版Ⅱ：1～2)。每個(gè)孢子囊內(nèi)，靠近兩個(gè)藥室之間的內(nèi)側(cè)造孢細(xì)胞的輪廓和細(xì)胞核比外側(cè)的大(圖版Ⅱ：1,3)。隨花藥的發(fā)育，孢子囊中央的孢原細(xì)胞分化為染色較淺的薄壁細(xì)胞，其細(xì)胞輪廓較大，染色淺，排列稀疏，發(fā)育為一團(tuán)不育隔膜組織(圖版Ⅱ：4～9)。孢子囊中央的不育隔膜組織并沒有橫貫花藥室，僅與兩個(gè)藥室內(nèi)側(cè)的花藥壁相連接(圖版Ⅱ：10)。與此同時(shí)，不育隔膜組織周圍的造孢細(xì)胞則發(fā)育為小孢子母細(xì)胞，繼續(xù)花粉發(fā)育過程。在小孢子母細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成小孢子四分體期間，隨著花藥壁中的絨氈層和中層細(xì)胞的降解，孢子囊和花藥壁之間出現(xiàn)明顯的空隙，同時(shí)不育隔膜組織也出現(xiàn)降解而在孢子囊中央形成空隙(圖版Ⅱ：11)。此時(shí)，位于孢子囊中央的小孢子四分體的輪廓明顯比外側(cè)的細(xì)胞輪廓大(圖版Ⅱ：12)。這樣的細(xì)胞輪廓差異一直持續(xù)到2-細(xì)胞型花粉時(shí)期(圖版Ⅱ：14～15)。雄配子體發(fā)育時(shí)期，同一個(gè)孢子囊內(nèi)的小孢子四分體進(jìn)行有絲分裂的過程是不同步的，靠外的小孢子四分體已經(jīng)完成了有絲分裂形成了2-細(xì)胞型花粉，而內(nèi)側(cè)的依舊處于小孢子四分體階段(圖版Ⅱ：12，15)。在雄配子發(fā)育階段，隨著兩個(gè)藥室靠近的內(nèi)花藥壁的斷裂消失，每個(gè)成熟的花粉團(tuán)內(nèi)的不育隔膜組織也被徹底吸收，形成了一對(duì)開口朝內(nèi)的孔裂花粉團(tuán)(圖版Ⅱ：13～14)。

2.3 巾唇蘭的花藥壁發(fā)育

花藥原基發(fā)育的早期，一層排列整齊的表皮細(xì)胞包圍著一團(tuán)染色較深的孢原細(xì)胞組織(圖版Ⅲ：1)。隨著花藥的發(fā)育，表皮下的一個(gè)孢原細(xì)胞充當(dāng)了初生周緣壁細(xì)胞的功能，通過平周分裂形成了兩個(gè)切向排列的子細(xì)胞(圖版Ⅲ：2)，靠外的為外次生周緣壁細(xì)胞，靠?jī)?nèi)的為內(nèi)次生周緣壁細(xì)胞(圖版Ⅲ：3)。接著，外次生周緣壁細(xì)胞直接發(fā)育為藥室內(nèi)壁細(xì)胞，內(nèi)次生周緣壁細(xì)胞進(jìn)行第二次平周分裂，形成兩個(gè)子細(xì)胞(圖版Ⅲ：4)。在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂前期，這兩個(gè)子細(xì)胞進(jìn)一步分化為中層和絨氈層(圖版Ⅲ：5～6)。此時(shí)發(fā)育完整的花藥壁，由外到內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，花藥壁發(fā)育模式符合單子葉型[21]。此時(shí)，表皮細(xì)胞開始變得細(xì)窄，出現(xiàn)降解，藥室內(nèi)壁細(xì)胞方闊型，中層細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，絨氈層細(xì)胞圓球形，單核。到小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ的末期，表皮細(xì)胞發(fā)生了變形和降解，藥室內(nèi)壁細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的帶狀纖維狀加厚，中層和絨氈層細(xì)胞已經(jīng)降解，花藥壁和花粉團(tuán)之間出現(xiàn)明顯空隙(圖版Ⅲ：7)。在小孢子四分體進(jìn)行有絲分裂形成2-細(xì)胞型花粉階段，花藥壁只剩下纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁和逐漸降解消失的表皮細(xì)胞殘跡(圖版Ⅲ：8～9)。

2.4 巾唇蘭的小孢子發(fā)育

早期花藥原基的表皮細(xì)胞下包圍著一團(tuán)染色較深的分生組織細(xì)胞，經(jīng)過多次有絲分裂形成相繼分化為造孢細(xì)胞和孢原細(xì)胞。這兩類細(xì)胞形態(tài)小、呈圓球形，排列緊密。接著，除了靠近兩個(gè)花粉團(tuán)之間的內(nèi)側(cè)花藥壁的少量孢原細(xì)胞分化為不育隔膜細(xì)胞組織外，大部分孢原細(xì)胞直接發(fā)育為小孢子母細(xì)胞(圖版Ⅱ：7)。小孢子母細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)濃厚，染色較深，逐漸液泡化，細(xì)胞壁外被明顯的胼胝質(zhì)(圖版Ⅳ：1～3)。小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂第一次分裂后形成了沒有子細(xì)胞壁的兩個(gè)子核(圖版Ⅳ：4)，保持在同一個(gè)細(xì)胞壁內(nèi)完成減數(shù)分裂Ⅱ(圖版Ⅳ：5)，產(chǎn)生了沒有明顯子細(xì)胞壁的4個(gè)子核，即小孢子四分體前體(圖版Ⅳ：6～8)。隨著發(fā)育的進(jìn)行，四個(gè)子核之間出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壁，形成了排列多樣的小孢子四分體(圖版Ⅳ：9)。因此，巾唇蘭的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型。小孢子四分體的排列多為正四面體、左右對(duì)稱和線型，稀交叉型(圖版Ⅳ：6～9)。在雄配子體發(fā)育階段，小孢子四分體并沒有散開，依舊處于同一個(gè)胼胝質(zhì)內(nèi)，通過有絲分裂形成了體積較大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和體積較小的生殖細(xì)胞(圖版Ⅳ：10)。隨后，生殖細(xì)胞融入到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)育為2-細(xì)胞型或2-核的成熟花粉(圖版Ⅳ：11)。成熟花粉以四合花粉的形式存在，兩兩緊密排列，構(gòu)成了質(zhì)地堅(jiān)硬的花粉團(tuán)(圖版Ⅱ：13～14)。雄配子體發(fā)育過程中，部分花藥室出現(xiàn)了花粉敗育的現(xiàn)象，已形成的小孢子四分體未能繼續(xù)有絲分裂，細(xì)胞輪廓模糊變形，發(fā)育停止(圖版Ⅳ：12)。

圖版Ⅰ 巾唇蘭的花形態(tài)特征 1.總狀花序；2.花形態(tài)正面圖，示唇瓣3裂，中裂片短小，側(cè)裂片長(zhǎng)；3～6.移去花萼和花瓣后的合蕊柱(3)和僅保留了唇瓣中裂片的合蕊柱(4～6)的正面(5)和側(cè)面(3,4,6)，示合蕊柱短，花粉團(tuán)一對(duì)，球形，具花藥帽；唇瓣基部具圓柱形的花距(3～4)，唇瓣側(cè)裂片邊緣具不規(guī)則的齒狀(3)，中裂片近舌型(4～5)，唇瓣中裂片表面具縱向褶皺突起(白色箭頭，4～6)，花藥帽前沿具一個(gè)二分叉的蕊喙結(jié)構(gòu)(白色箭頭，上側(cè)，5)；7～9.花粉團(tuán)的背面(7)、側(cè)面(8)和正面(9) ac.花藥帽；c.合蕊柱；lip.唇瓣；lll.唇瓣側(cè)裂片，mll.唇瓣中裂片；p.花粉團(tuán)；sp.距；s.粘盤柄；v.粘盤 花粉團(tuán)的這三個(gè)面皆全緣，無裂縫或孔。Plate Ⅰ Floral morphology in P.yunnanense 1.An inflorescence; 2.A flower in front view,showing a 3-lobed lip; 3-6.The column with sepals and petals removed(3),and with middle lobe of lip remained(4～6),in side views(3,4,6) and front view(3),showing a short colum,a cylindrical spur,two lateral lobes of lip with fimbriate margin(3),the middle lobe of lip(4,5) with longitudinal folds on upper surface(white arrows,4-6),the anther cap with a biforked beak at the front end(black arrow,5); 7-9. The back(7),side(8),and front(9) views of two pollinia,note that the pollinia are entire in these views,without cleft or pore ac.Anther cap; c.Column; lll.Lateral lobe of lip; mll.Mid lobe of lip; p.Pollinium; sp.Spur; s.Stipe; v.Viscidium

圖版Ⅱ 巾唇蘭的花粉團(tuán)發(fā)育 1～2.早期的花藥原基分化為一對(duì)側(cè)生并列的橢圓形藥室，朝唇瓣方向彎曲生長(zhǎng)，一對(duì)花藥室的橫切圖(1)，單個(gè)花藥室的側(cè)面縱切(2)；3.圖1方框部分的放大圖，示造胞細(xì)胞的輪廓在小孢子囊中央(右側(cè)，3)的比外側(cè)的大(左側(cè)，3)；4～10.小孢子囊中央的造孢細(xì)胞分化為一團(tuán)染色較淺的薄壁組織細(xì)胞(箭頭所示，4)，細(xì)胞輪廓大，排列稀疏(6，8～9)，發(fā)育為一段不橫貫藥室的不育隔膜組織(箭頭所指，10)；11～12.小孢子四分體時(shí)期，花藥壁的中層和絨氈層降解消失，孢子囊和花藥壁之間出現(xiàn)明顯空隙，孢子囊內(nèi)的不育隔膜組織也出現(xiàn)降解形成空隙(箭頭所指，11)，且小孢子囊中央的小孢子四分體(上部，12)輪廓明顯比外圍的大(下部，12)；13～15. 2-細(xì)胞型花粉時(shí)期，形成兩個(gè)開口朝內(nèi)的孔裂花粉團(tuán)(箭頭所指，13)，單個(gè)花粉團(tuán)的側(cè)面縱切圖(14)，此時(shí)同一個(gè)孢子囊內(nèi)的花粉有絲分裂不同步，靠外的輪廓小的小孢子四分體已發(fā)育為2-細(xì)胞型四合花粉(底部，15)，靠?jī)?nèi)的輪廓大的細(xì)胞尚處在小孢子四分體階段(上部，15) Cn.藥隔組織；C.合蕊柱；Po.花粉團(tuán)；Sp.孢子囊；Ss.隔膜組織；La.唇瓣P(guān)late Ⅱ Pollinia development in P.yunnanense 1-2. The anther primordium differentiated into a pair of lateral juxtaposed thecae bending toward to the lip,transverse section of a pair of thecae(1),and of a single theca in side view(2); 3. Magnified view of a part of fig.1,showing the sporogeneous cells in the center(the right side of fig.3) larger than those surrounding(the left side of fig.3); 4-10. The sporogenous cells in the center of the microsporangium differentiated into a group of light stained parenchyma(arrow,4),with large cells and arranged loosely(6,8,9),an incompletely sterile septum cross the thecae(arrow,10); 11-12. Microspore tetrad stage,the middle layer and tapetum degraded with an evident gap between sporangium and anther wall,the sterile septum degraded(arrow,11),noting that the microspore tetrads in the center of the microsporangium(the top of fig.12) is significantly larger than those surrounding(the bottom of fig.12); 13-15. The sterile septum completely disappeared,forming two pollinia with the stomium lying between two thecae(asterisk,13); longitudinal section of a single theca in side view(14),asynchronism in male gametogenesis,noting that the tetrads surrounding at 2-celled pollen stage(the lower side of fig.15),while those in the center microspore at the microspore tetrad stage(the top of fig.15) Aw.Anther wall; Cn.Connective tissue; C.Column; Po.Pollinium; Ss.Sterile septum; St.Sporogenous tissue; La.labellum

圖版Ⅲ 巾唇蘭的花藥壁發(fā)育 1.早期的花藥原基為一層排列整齊的表皮細(xì)胞包圍著一團(tuán)染色較深的孢原細(xì)胞細(xì)胞組織，注意表皮細(xì)胞正進(jìn)行垂周分裂(箭頭)；2～3.表皮細(xì)胞下的一個(gè)孢原細(xì)胞正在平周分裂產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞(箭頭，2)，靠外的為外次生周緣壁細(xì)胞，靠?jī)?nèi)的為內(nèi)次生周緣壁細(xì)胞(3)；4.小孢子母細(xì)胞時(shí)期，外次生周緣壁細(xì)胞發(fā)育為藥室內(nèi)壁，內(nèi)次生周緣細(xì)胞通過一次平周分裂，形成兩個(gè)子細(xì)胞(箭頭)；5～6.減數(shù)分裂前期，花藥壁發(fā)育完整，由外到內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層。7.減數(shù)分裂后期，表皮、中層和絨氈層已經(jīng)降解，藥室內(nèi)壁增大且發(fā)生纖維狀加厚；8～9.小孢子四分體(8)和2-細(xì)胞花粉時(shí)期的花藥壁，表皮細(xì)胞逐漸降解，藥室內(nèi)壁繼續(xù)保持不均勻纖維狀加厚 Ep.表皮；En.藥室內(nèi)壁；Isp.內(nèi)次生周緣細(xì)胞；Ml.中層；Osp.外次生周緣細(xì)胞；Ta.絨氈層Plate Ⅲ The development of anther wall in P.yunnanense 1. A densely-stained sporogenous tissue surrounded by a layer of epidermal cells,noting that the epidermal cells were undergoing anticlinal division(arrows); 2-3. The hypodermal archesporial cells undergo a periclinal division resulting two daughter cells(arrow in 2),including the outer and the innner secondary parietal cells; 4. At the stage of microsporocyte,the outer secondary parietal cells function as endothecium,while the inner ones keep on producing two daughter cells(arrow); 5-6. The completed anther wall consisting of 4 layers,including epidermis,endothecium,middle layer,and a tapetum; 7. At the end of meiosis Ⅱ,the middle layer and tapetum were degraded,fibrous thickening occurred in the endothecium; 8-9. Anther wall at microspore tetrad stage(8) and 2-celled pollen stage,noting the epidermis gradually degraded,and endothecium became fibrous thickened Ep.Epidermis; En.Endothecium; Isp.Inner secondary parietal layers; Ml.Middle layer; Osp.Outer secondary parietal layer; Ta.tapetum

圖版Ⅳ 巾唇蘭的小孢子發(fā)育 1.孢原細(xì)胞；2.小孢子母細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的液泡(箭頭)；3～9.小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程:減數(shù)分裂I前期(3)，減數(shù)分裂Ⅰ后期(4)和減數(shù)分裂Ⅱ前期，注意未形成子細(xì)胞壁(5)，減數(shù)分裂Ⅱ后期(6)，減數(shù)分裂Ⅱ末期，小孢子四分體尚未形成細(xì)胞壁，4個(gè)子核排列呈正四面體(7)或左右對(duì)稱(8)；形成子細(xì)胞壁的小孢子四分體呈左右對(duì)稱排列(9)；10～11.雄配子體發(fā)育過程，小孢子四分體保持在同一個(gè)胼胝內(nèi)繼續(xù)有絲分裂，形成小的生殖細(xì)胞和大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(10)，接著，生殖細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞之間的細(xì)胞壁溶解后發(fā)育為2細(xì)胞型花粉(12)；12.部分花藥內(nèi)靠近外側(cè)花藥壁的小孢子四分體未能繼續(xù)完成有絲分裂，而出現(xiàn)敗育 Gc.生殖細(xì)胞；Vc.營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞Plate Ⅳ The Microsprogenesis in P.yunnanense 1.Sporogenous cells; 2.Microspore mother cells; 3-9.Meiosis of microspore mother cells: Prophase Ⅰ(3),Anaphase Ⅰ(4),Prophase Ⅱ(5), Anaphase Ⅱ(6-8),noting the arrangements of microspore tetrads without cell walls in tetrahedral(6,7),isobilateral(8); 9.Microspore tetrads arranged in isobilateral type,noting the cell walls formed; 10～11.The microspore underwent a mitotic division and developed into 2-celled pollen; 12.Abortion of pollen at the stage of microspore,noting the distorted cells Gc.Generative cell; Vc.Vegetative cell

3 討論

本文通過解剖鏡和石蠟切片技術(shù)，觀察了巾唇蘭的花形態(tài)和花藥發(fā)育過程，從成熟花的形態(tài)解剖特征和花藥發(fā)育的組織切片水平揭示了一些具有重要分類學(xué)意義的胚胎學(xué)特征，具體如下。

第一，本研究從組織切片水平揭示了巾唇蘭兩個(gè)孔裂花粉團(tuán)的形成機(jī)制，證實(shí)了早期花藥發(fā)育過程中，小孢子囊內(nèi)孢原細(xì)胞組織分化出不同類型的不育隔膜組織對(duì)蘭科中花粉團(tuán)的數(shù)目和形態(tài)特征的形成具有決定性作用[22]。巾唇蘭的隔膜組織的發(fā)育模式很特別，隔膜組織起源于藥室中央分化為不育隔膜組織的一團(tuán)孢原細(xì)胞。隨著花藥生長(zhǎng)，這段隔膜組織一端始于小孢子囊中央，另一端延伸至兩個(gè)藥室相鄰的內(nèi)側(cè)花藥壁。在發(fā)育過程中，該隔膜組織逐步降解，至花藥成熟時(shí)徹底消失，在兩個(gè)藥室相鄰的內(nèi)側(cè)花藥壁斷裂處形成孔隙，發(fā)育為一對(duì)開口朝內(nèi)的孔裂花粉團(tuán)。已有研究表明，在蘭科不同的類群中，隔膜組織分化的有無、數(shù)目及發(fā)育朝向?qū)τ诨ǚ蹐F(tuán)的不同數(shù)目及其表面形態(tài)特征的形成機(jī)制具有重要作用[22～23]。在樹蘭亞科的花粉團(tuán)發(fā)育過程中，如果花藥室內(nèi)沒有出現(xiàn)隔膜組織，就會(huì)形成2個(gè)實(shí)心花粉團(tuán)，如Stelisciliaris；如果花藥室內(nèi)發(fā)生的部分分隔(沒有形成完整的隔膜組織)，可能形成淺裂花粉團(tuán)(lobed pollinia)，如合萼蘭屬(Acriopsis)或具孔的花粉團(tuán)；如果每個(gè)花藥室內(nèi)都形成一個(gè)背腹向隔膜組織，將形成最常見的4個(gè)花粉團(tuán)，如沼蘭屬(Malaxis)，石仙桃屬(Pholidota)，蓋喉蘭屬(Smitinandia)；而蝦脊蘭屬(Calanthe)等8個(gè)花粉團(tuán)可由兩條縱向或一縱一橫的隔膜組織切割而成[22～23]。

第二，從個(gè)體發(fā)育組織解剖水平，本文澄清了巾唇蘭的花粉團(tuán)具孔裂，而非如前人所描述的那樣全緣[8,13～14]或?qū)嵭腫10]。在解剖鏡下，巾唇蘭成熟花藥中有一對(duì)由粘盤和粘盤柄相連接的球形花粉團(tuán)，該花粉團(tuán)從正面、側(cè)面和背面皆為全緣，無孔裂或淺裂，這與前人的描述是一致的。然而，本文通過石蠟切片觀察到成熟花藥的縱切面上，每個(gè)藥室內(nèi)的花粉團(tuán)在靠近兩個(gè)藥室相鄰的內(nèi)花藥壁處，存在著一條開口朝內(nèi)花藥壁處的空隙。這說明巾唇蘭的花粉團(tuán)并非全緣或?qū)嵭?，而是孔裂?；ǚ蹐F(tuán)孔裂的特征，從花藥發(fā)育過程的組織切片上可以得到追蹤和證實(shí)。早期花藥原基分化出的一對(duì)側(cè)生藥室內(nèi)，其中央分化出一段不育隔膜組織，始于藥室中央，止于兩個(gè)藥室相鄰的內(nèi)側(cè)花藥壁組織。在花藥成熟時(shí)，兩個(gè)藥室相鄰的內(nèi)側(cè)花藥壁發(fā)生降解形成藥室裂口，同時(shí)這段不育隔膜組織也被全部吸收，在兩個(gè)成熟的花藥室相鄰的地方形成一道開口朝內(nèi)的一對(duì)孔裂花粉團(tuán)。由于花粉團(tuán)的孔裂開口位于兩個(gè)花粉團(tuán)緊密相連處，在解剖鏡下不易觀察到，但在組織切片水平上卻可以完整地看到該孔裂的形成機(jī)制。因此，從這個(gè)角度而言，對(duì)于具有不同形態(tài)特征的花粉團(tuán)來說，一方面需要全方位仔細(xì)觀察成熟花粉團(tuán)的形態(tài)特征，另一方面對(duì)于開口較小或不易察覺的孔裂或淺裂的花粉團(tuán)，可以通過組織切片技術(shù)來進(jìn)一步澄清。

第三，巾唇蘭兩個(gè)孔裂花粉團(tuán)的形成機(jī)制，對(duì)于萬代蘭族2個(gè)花粉團(tuán)特征及其形成機(jī)制具有重要的啟示作用。在巾唇蘭所處的萬代蘭族指甲蘭亞族的類群中，花粉團(tuán)的數(shù)目和形態(tài)特征描述在近緣類群甚至一個(gè)屬內(nèi)都不一致，無論是傳統(tǒng)的形態(tài)分類和分子系統(tǒng)學(xué)都很難用來反映它們的系統(tǒng)親緣關(guān)系[13～15,24]。根據(jù)前人的研究，一些在分子系統(tǒng)樹上親緣關(guān)系比較近的指甲蘭亞族類群，往往具有不同數(shù)目和形態(tài)特征的花粉團(tuán)的描述[13～15,24]。例如，在巾唇蘭屬所在的囊唇蘭近緣類群分支中，巾唇蘭同我國(guó)分布的囊唇蘭和管唇蘭以及其他2個(gè)小屬(Ceratocentron,Hymernorchis)都被描述為具有一對(duì)全緣的花粉團(tuán)，但在其它屬里卻分別具有孔裂花粉團(tuán)孔裂花粉團(tuán)(如：Dyakia,Cryptophylos)和淺裂花粉團(tuán)(如：Macropodanthus,Amesiella)。在指甲蘭屬的近緣類群中，風(fēng)蘭屬(Neofinetia)和槽舌蘭(Holocoglossum)具有一對(duì)孔裂花粉團(tuán)；但萬代蘭屬和鉆喙蘭屬(Rhyncostylis)以及國(guó)外的一個(gè)小屬(Trudelia)具有一對(duì)帶裂縫的花粉團(tuán)。甚至在同一個(gè)屬里花粉團(tuán)也被描述為既有孔裂和淺裂，例如指甲蘭屬和鳥舌蘭屬。除了在同一個(gè)近緣類群分支或同一個(gè)屬中，花粉團(tuán)的形態(tài)特征有不同的描述之外，花粉團(tuán)的數(shù)目也有變異，例如：Pomatocalpa的近緣分支類群中，Pomatocalpa有4個(gè)，Haraella有2個(gè)；同樣，Diploprora的近緣類群中，Diploprora有4個(gè)花粉團(tuán)，而另外兩個(gè)屬(Omoea,Malleola)有2個(gè)。在蝴蝶蘭屬中，花粉團(tuán)數(shù)目也有2個(gè)或4個(gè)的描述。面對(duì)萬代蘭指甲蘭亞族的花粉團(tuán)形態(tài)特征的不同描述給分類系統(tǒng)帶來的困惑[13～15,24]，本研究結(jié)果說明對(duì)于萬代蘭族指甲蘭亞族錯(cuò)綜復(fù)雜的分類系統(tǒng)學(xué)問題，對(duì)花粉團(tuán)的不同的數(shù)目或形態(tài)特征形成機(jī)制，有必要從花藥發(fā)育的個(gè)體形態(tài)解剖水平上進(jìn)一步研究，準(zhǔn)確判斷花粉團(tuán)的形態(tài)類型。

第四，巾唇蘭的花距、無蕊柱足、花粉團(tuán)形態(tài)、粘盤等特征在屬間及種間具有重要的分類學(xué)意義。巾唇蘭屬是J.J.Sm.于1914年由囊唇蘭屬中分隔出來的[18～19]，通過對(duì)巾唇蘭花形態(tài)解剖特征觀察，支持J.J.Sm.將巾唇蘭屬由囊唇蘭屬中分隔出來。從花形態(tài)解剖特征來看，巾唇蘭和囊唇蘭的區(qū)別顯著，巾唇蘭的花距明顯，為長(zhǎng)圓柱形，無蕊柱足，具有一對(duì)孔裂花粉團(tuán)；而囊唇蘭的唇瓣基部的花距短，為圓筒狀距形，有蕊柱足，花粉團(tuán)為全緣[25～26]。因此，花距長(zhǎng)圓柱形、花粉團(tuán)孔裂，蕊柱足不明顯等形態(tài)解剖特征支持巾唇蘭屬應(yīng)該從囊唇蘭屬中分離出來。此外，根據(jù)本文的研究結(jié)果，我國(guó)產(chǎn)的兩種巾唇蘭屬植物在花形態(tài)特征方面較為相似[11]，球形花粉團(tuán)，橢圓形的粘盤以及由上至下擴(kuò)大呈翼型或長(zhǎng)三角型條帶的粘盤柄，明顯的區(qū)別在于巾唇蘭的花梗和子房旋轉(zhuǎn)，而鴕鳥巾唇蘭的不旋轉(zhuǎn)[11]。顯然，關(guān)于和巾唇蘭屬一樣曾被描述為具有2個(gè)全緣花粉團(tuán)的近緣屬(管唇蘭屬，火炬蘭屬，蝦尾蘭屬)來說，花粉團(tuán)是否全緣或孔裂這一關(guān)鍵分類學(xué)特征也需要花粉團(tuán)發(fā)育的解剖證據(jù)來進(jìn)一步澄清。

第五，巾唇蘭花藥發(fā)育過程中的一些胚胎學(xué)特征反映了蘭科花藥發(fā)育的多樣性和普遍性，為更好地理解蘭科分類系統(tǒng)和演化提供新證據(jù)。例如，單子葉型的花藥壁發(fā)育類型、表皮細(xì)胞的過早降解、單核絨氈層、同時(shí)型胞質(zhì)分裂、小孢子四分體排列形式、雄配子體發(fā)育過程中的同步性以及2-細(xì)胞型的成熟花粉等特征在不同的亞科、族和屬間都明顯不同，具有一定的分類學(xué)意義。

首先，巾唇蘭的單子葉型花藥壁發(fā)育方式和表皮細(xì)胞不宿存等特征豐富了蘭科花藥發(fā)育的多樣性。巾唇蘭成熟的花藥壁有4層細(xì)胞，發(fā)育方式符合單子葉型。目前，蘭科植物花藥壁發(fā)育類型有兩種：?jiǎn)巫尤~型和多層型(massive type)。單子葉型花藥壁是指發(fā)育完整的花藥壁有4層細(xì)胞組成：表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層[21]。單子葉型花藥壁在樹蘭亞科的萬代蘭族見于萬代蘭屬(Vanda)、指甲蘭屬(Aerides)、鉆喙蘭屬[27]，在其他類群中還見于小斑葉蘭(Goodyerarepens)[28]、沼蘭屬(Malaxisversicolor、M.muscifera)[29～30]、Microstyliscylindrostachya[31]、線柱蘭屬的Zeuxinestrateumatica[32]等。多層型花藥壁是在羊耳蒜屬(Liparis)植物中首次提出來的，其發(fā)育完整的花藥壁有5～8層，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了被子植物中其他類型(基本型，雙子葉型，單子葉型，退化型)花藥壁的組成層數(shù)，因此被命名為新的花藥壁類型：多層型[33]。多層型花藥壁層數(shù)的增加源于藥室內(nèi)壁或中層層數(shù)的增加，可多達(dá)2～5層。因此，多層型花藥壁層數(shù)可達(dá)6～10層以上。多層型花藥壁還見于杓蘭亞科的杓蘭屬(Cypripedium)[34]，蘭亞科的綬草屬(Spiranthus)和蘭屬(Cymbidium)[35]以及樹蘭亞科的苞舌蘭屬(Spathoglottis)[36]。因此，花藥壁發(fā)育類型在蘭科分類系統(tǒng)中具有重要作用。同時(shí)，巾唇蘭的花藥壁的表皮細(xì)胞并非宿存，表現(xiàn)為過早降解。這個(gè)發(fā)育特征在蘭科植物中比較少見。表皮細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，表現(xiàn)為被拉伸和壓縮，細(xì)胞輪廓變得細(xì)長(zhǎng)，出現(xiàn)降解的跡象，在花藥成熟時(shí)，花藥壁僅剩藥室內(nèi)壁和部分表皮的殘跡。這意味著巾唇蘭的表皮細(xì)胞過早降解。然而，在現(xiàn)有的蘭科花藥發(fā)育的資料中，表皮細(xì)胞通常宿存[37～39]。關(guān)于表皮細(xì)胞的過早退化或降解的分類學(xué)意義，有待于更多資料的補(bǔ)充。

其次，巾唇蘭花藥發(fā)育過程中的一些特征與大部分蘭科的相似，反映了蘭科花藥發(fā)育的普遍性。例如，巾唇蘭小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型，在蘭科資料中較為常見?，F(xiàn)有資料表明，蘭科花藥發(fā)育過程中的減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂有兩種：同時(shí)型和連續(xù)型。前者較為普遍，在早期大部分蘭科植物都很普遍[40]；后者較為少見，見于陸續(xù)報(bào)道的部分蘭科，如：樹蘭亞科的虎舌蘭屬(Epipogium)[41]和苞舌蘭屬[36]，蘭亞科的眉蘭屬(Ophrys)[42]和綬草屬[43]。大部分蘭科植物中的絨氈層為腺質(zhì)型，且普遍為單核，這在巾唇蘭中也不例外。然而，在部分蘭科成員中，也有雙核絨氈層，如杓蘭亞科的兜蘭屬(Paphiopedilumdruryi)[27]、樹蘭亞科的火燒蘭屬(Epipactislatifolia，E.veratrifolia)[44]。巾唇蘭的小孢子四分體排列形式多樣，多為正四面體和左右對(duì)稱，稀十字交叉型或線型，且成熟花粉粒為2細(xì)胞型。以上這些特征在現(xiàn)有蘭科資料中都較為常見[40]，可以算作蘭科花藥發(fā)育的普遍特征。

此外，在巾唇蘭花藥發(fā)育過程中，同一個(gè)藥室內(nèi)存在著花粉敗育現(xiàn)象。敗育時(shí)間主要發(fā)生在小孢子四分體時(shí)期，靠近花藥壁的小孢子四分體細(xì)胞輪廓變形，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核不清晰，出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，而處于藥室中央的小孢子四分體形態(tài)正常，繼續(xù)發(fā)育。這樣的敗育現(xiàn)象也許因?yàn)榛ㄋ幈诘慕q氈層和中層細(xì)胞已經(jīng)完全降解，因此靠近花藥壁的小孢子四分體無法繼續(xù)獲得更多營(yíng)養(yǎng)繼續(xù)發(fā)育而出現(xiàn)敗育。相反，靠近藥室中央的孢子囊，由于隔膜組織細(xì)胞層數(shù)多，尚未降解完全，依舊可以繼續(xù)為小孢子四分體進(jìn)一步發(fā)育為雄配子體而提供營(yíng)養(yǎng)，因此發(fā)育正常。同時(shí)，考慮到蘭科花藥內(nèi)大量的花粉聚集成團(tuán)，數(shù)目多達(dá)上百萬，由于營(yíng)養(yǎng)供給有限，導(dǎo)致了部分花粉的敗育。由于花藥發(fā)育過程中，存在花粉敗育現(xiàn)象，導(dǎo)致了并非所有的小孢子母細(xì)胞都可以順利發(fā)育為成熟花粉，限制了蘭科雙受精過程所必需的雄配子體數(shù)量的供給。因此，巾唇蘭花粉團(tuán)發(fā)育過程中存在的花粉敗育現(xiàn)象，也從一定角度解釋了野生蘭科植物種群數(shù)量稀少，除了人為活動(dòng)干擾外，還存在著一定的生殖機(jī)制障礙。

綜上所述，本文首次為新種巾唇蘭的花粉團(tuán)發(fā)育提供了重要的胚胎學(xué)特征，為蘭科植物的系統(tǒng)演化和生殖生物學(xué)提供了科學(xué)依據(jù)。然而考慮到蘭科多達(dá)800屬26 000種的龐大成員，且在亞科內(nèi)的不同族、亞族和屬間的系統(tǒng)親緣關(guān)系亟待澄清[16～17]，因此選擇具有代表性的蘭花觀察花藥發(fā)育特征，進(jìn)行比較胚胎學(xué)研究是多多益善的[27～28]。

致謝本研究依托西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)完成；西南林業(yè)大學(xué)科研教學(xué)實(shí)習(xí)基地(云南省豐春坊生物科技有限公司蘭花基地)提供實(shí)驗(yàn)材料；西南林業(yè)大學(xué)古旭老師在實(shí)驗(yàn)過程中提供幫助。