城市常見落葉的纖維素高效降解菌種分離

高 樂,惠 璠,郭雅妮,姜 潔

(1.陜西省現(xiàn)代建筑設(shè)計(jì)研究院,陜西 西安 710048;2.西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

0 引 言

城市綠化廢棄物屬于可再生能源,具備良好的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值,處理得當(dāng)可解決綠化廢棄物的消納問題,一舉兩得[1]。目前針對(duì)城市綠化廢棄物處理的主要途徑有焚燒、填埋、堆肥。焚燒產(chǎn)生的大量污染物會(huì)造成二次污染,且無法有效利用燃燒產(chǎn)生的熱量[2];填埋對(duì)于綠化廢棄物的處理效果非常有限,不僅占用寶貴的土地資源,且循環(huán)周期較長[3];相比而言,城市綠化廢棄物的堆肥化處理具備經(jīng)濟(jì)、安全的特性,是綠化廢棄物資源化利用的重要途徑[4]。

落葉是綠化廢棄物的主要組成部分,通過微生物降解轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)或有機(jī)營養(yǎng)物,最終得到腐熟的堆肥產(chǎn)品[5],可作為土壤改良劑、有機(jī)肥和栽培基質(zhì)，完成資源化利用[6]。微生物在城市綠化廢棄物堆肥處理中起著至關(guān)重要的作用[7],但由于落葉中纖維素含量較高且難降解,導(dǎo)致其堆肥周期一般較長,使大規(guī)模進(jìn)行落葉堆肥處理受到限制[8]。因此,為提高以落葉為主的綠化廢棄物堆肥效率、堆肥質(zhì)量,加快堆肥腐熟，縮短堆肥周期就顯得非常必要。而目前的研究僅停留在降解效果的測(cè)定和直接利用商業(yè)菌種堆肥,鮮有分離有效促進(jìn)纖維素降解的優(yōu)勢(shì)菌為目的的研究[9-10]。

本文以中國北方城市最常見落葉(懸鈴木落葉、小葉女貞落葉)為原料,以易得的污水廠剩余污泥、土壤、豬糞、雞糞等不同菌劑對(duì)落葉進(jìn)行微生物降解,特別針對(duì)其中難降解的纖維素類物質(zhì)進(jìn)行降解,以期通過分離獲得利于堆肥化處理的纖維素高效降解菌種,為縮短綠化廢棄物堆肥周期提供基礎(chǔ)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 以中國北方城市常見落葉—懸鈴木落葉、小葉女貞落葉為材料(取自西安市市區(qū))。將原材料按要求進(jìn)行烘干、粉碎(粒徑約5 mm，用于降解實(shí)驗(yàn))，研磨、過60目篩，用于各指標(biāo)測(cè)定。

豬糞、雞糞(取自西安市臨潼區(qū)某養(yǎng)殖場); 剩余污泥(取自西安市某污水處理站);土壤(取自西安工程大學(xué)臨潼校區(qū)花園)；商品菌劑為液體農(nóng)富康種植菌液;泔水(取自西安工程大學(xué)臨潼校區(qū)食堂)。

1.1.2 試劑 蛋白胨、酵母膏、羧甲基纖維素鈉、瓊脂為生化試劑,其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器 多功能粉碎機(jī)(9F-330型,河南省滎陽市永興機(jī)器廠);恒溫水浴振蕩槽(DKZ-2型,杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋(YX280B型,上海三申醫(yī)療器械有限公司);控溫消煮爐(KXL1010型,北京京晶科技有限公司);生化培養(yǎng)箱(SPX-250B型,上海市醫(yī)療器械批發(fā)部);電熱恒溫干燥箱(DHG-9247A,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5810R,EPPENDORF公司);紫外分光光度計(jì)(V-1100,上海美譜達(dá)儀器有限公司);電子天平(ESJ120-4,沈陽龍騰電子有限公司);凝膠電泳儀(DYY-6C 型,北京六一儀器廠);PCR 儀(TP600型,日本 Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料組分測(cè)定 1) 含水率的測(cè)定:采用稱重法測(cè)定樣品含水率。

2) 總有機(jī)碳的測(cè)定[11]:

C=[0.003(V0-V)CFe/m]×100%

式中:C為樣品有機(jī)碳質(zhì)量百分比;V0為空白樣滴定消耗的FeSO4體積(mL);V為樣品滴定消耗的FeSO4體積(mL);CFe為FeSO4溶液濃度(mol·L-1);m為落葉樣品的質(zhì)量(g);0.003為1/4碳原子的毫摩爾質(zhì)量(g·mmol-1)。

3) 總氮的測(cè)定:稱取烘干過篩備用的落葉樣品0.500 0 g,用凱氏定氮法在分光光度計(jì)210 nm波長處,以無氨水作參比,進(jìn)行總氮的測(cè)定[12]。

4) 纖維素的測(cè)定[13]:精確稱取烘干過篩備用的樣品(18±0.001) g,加入100 mL酸性洗滌劑,煮沸1 h后坩堝過濾,經(jīng)300 mL熱水(90 ℃)反復(fù)洗滌,再用丙酮洗滌2～3次,直至濾液呈無色為止;置于烘箱105 ℃烘5 h,冷卻后稱重。

1.2.2 落葉降解實(shí)驗(yàn) 將落葉根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自然風(fēng)干,粉碎機(jī)破碎至前期實(shí)驗(yàn)確定的最佳粒徑5 mm左右[14];取約100 g烘干粉碎的落葉放入500 mL錐形瓶稱重,加入粒徑6～8 mm的級(jí)配碎石以防結(jié)塊,碎石經(jīng)過自來水浸洗3次,按照落葉的30%加入。

單組分菌劑分別為土壤、污泥、豬糞、雞糞、購買菌液,雙組分菌劑分別為土壤+污泥、土壤+豬糞、土壤+雞糞、土壤+菌液、污泥+豬糞、污泥+雞糞、污泥+菌液、豬糞+雞糞、豬糞+菌液、雞糞+菌液。物料與菌劑的添加比例為3∶1(質(zhì)量比),雙組份菌劑按照1∶1(質(zhì)量比)混合,同時(shí)設(shè)置一組空白對(duì)照。將以上物料混勻,利用稀釋的泔水調(diào)節(jié)含水率至50%～60%,具體表現(xiàn)為用手抓起物料,指縫有水滲出,但水不滴落為宜。按照降解物料的1%添加尿素,錐形瓶稱重后將樣品置恒溫振蕩培養(yǎng)箱(50 ℃)進(jìn)行好氧降解實(shí)驗(yàn),每隔72 h取樣一次,共取樣5次。實(shí)驗(yàn)開始后,前3天每隔4 h人工攪拌;其余均在每天早、中、晚固定時(shí)間段攪拌以保證物料的供氧和防止物料結(jié)塊。

1.2.3 纖維素分解菌的分離 以降解效果最佳的菌劑與落葉混合降解15 d的產(chǎn)物為菌種來源。在無菌超凈工作臺(tái)上稱取樣品1.0 g,稀釋法制備10-2～10-6倍的稀釋液[15]。

吸取不同梯度稀釋液100 μL,加入纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基中,涂布法進(jìn)行細(xì)菌和真菌分離培養(yǎng),每個(gè)梯度稀釋液平行涂布平板3個(gè)。將細(xì)菌置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,觀察不同梯度平板中菌落數(shù)量及分布情況。挑選菌落分布較均勻的平板,根據(jù)不同的菌落形態(tài)特征,分別挑取單個(gè)菌落,劃線接種于新的纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基上。將純化2～3次后的菌株接種于纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基中,放入培養(yǎng)振蕩器(轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度25 ℃)中震蕩培養(yǎng)12～24 h。真菌平板于30 ℃倒置培養(yǎng)72 h,觀察不同梯度平板中菌落數(shù)量及分布情況,篩選出優(yōu)勢(shì)數(shù)量菌落并且分布均勻的梯度平板。根據(jù)不同菌落形態(tài)特征,分別挑取單菌落接種到新的纖維素剛果紅培養(yǎng)基上純化2～3次,將純化后的菌株于30 ℃培養(yǎng)72 h后置于4 ℃冷藏保存。

利用剛果紅染色法,根據(jù)菌落透明圈出現(xiàn)早晚和大小初步判斷菌株產(chǎn)酶情況[16],菌落透明圈數(shù)量越多,面積越大,表示該菌種對(duì)纖維素的降解效果越好。

1.2.4 纖維素分解菌的鑒定 鑒定方法見文獻(xiàn)[17-18]。提取真菌基因組DNA,并以其為模板，選用文獻(xiàn)[19]真菌rDNA ITS基因克降引物,擴(kuò)增菌株的基因序列。反應(yīng)體系:H2O 17.8 μL,Buffer 3 μL,d NTP 2 μL,Primer1 3 μL,Primer2 3 μL,DNA 模板1 μL,酶0.2 μL;總體積30 μL。反應(yīng)條件:① 95 ℃， 5 min。② 95 ℃，30 s；55℃，30 s；72 ℃，1 min；35 cycles。③ 72 ℃，10min。④ 12℃，forever。

利用ITS 通用引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[20]。

將含有真菌菌株的PCR產(chǎn)物送至上海天昊生物科技完成后續(xù)的菌株測(cè)序[21]。

在GenBank上對(duì)以上步驟檢測(cè)的序列進(jìn)行Blast比對(duì),獲得同源性序列,再利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 落葉混合物成分測(cè)定

表1為落葉混合物的成分表。由表1可知,落葉混合物作為降解底物，其C/N為38.35,纖維素含量較高,為48.4%。

表 1 落葉混合物的成分測(cè)定Tab.1 The composition determination of fallen leaves mixture

2.2 單組份菌劑對(duì)落葉的降解

2.2.1 總有機(jī)碳的降解 單組份菌劑降解落葉混合物過程中總有機(jī)碳的變化見圖1。由圖1可以看出,落葉混合物中的總有機(jī)碳含量整體呈下降趨勢(shì),且發(fā)酵前期變化迅速,后期變化逐漸緩慢。分析認(rèn)為發(fā)酵初期微生物活動(dòng)較后期更為活躍,因此表現(xiàn)出發(fā)酵前期總有機(jī)碳的含量下降迅速。以落葉為原料的發(fā)酵中總有機(jī)碳的含量均很高,在發(fā)酵第15天時(shí),雞糞發(fā)酵組的總有機(jī)碳利用率最高,總有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至24.81%,其次為商品菌劑發(fā)酵組,可降至24.95%。

圖 1 單組份菌劑降解落葉過程中總有機(jī)碳的變化Fig.1 The change of TOC during fallen leaves degrading by single inoculants

2.2.2 總氮的降解 單組份菌劑降解落葉混合物過程中總氮的變化見圖2。由圖2可以看出,在發(fā)酵原料情況相同,加入不同微生物菌劑后處理的總氮含量出現(xiàn)差異。隨著降解時(shí)間的延長,總氮含量整體呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì),其中添加剩余污泥菌劑的堆肥,在第15天時(shí)總氮含量最高,達(dá)到1.72%,其余處理的發(fā)酵物中總氮含量有較小差異。所有處理的最終物料中總氮含量均高于原料,是因?yàn)榻到庖鹂傮w積和質(zhì)量的下降,導(dǎo)致后期總氮含量的上升。

圖 2 單組份菌劑降解落葉過程中總氮的變化Fig.2 The change of TN during fallen leaves degrading by single inoculants

2.2.3 C/N的變化 C/N是檢驗(yàn)原料腐熟度的一個(gè)重要指標(biāo),C/N從最初的高于35～40降低到18～20。一般認(rèn)為其數(shù)值達(dá)到20以下就達(dá)到腐熟,即穩(wěn)定的程度,此時(shí)發(fā)酵的碳氮比趨向于微生物菌體的碳氮比。單組份菌劑降解落葉混合物過程中碳氮比的變化見圖3。由圖3可以看出,降解過程中,C/N總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且變化幅度較大。第9天左右雞糞對(duì)原料的降解就可達(dá)到20以下,表示處于腐熟狀態(tài),其余的菌劑在降解時(shí)間延長至第12天之后,可以降至C/N小于20。

2.2.4 纖維素的降解 單組份菌劑降解落葉混合物過程中纖維素含量的變化見圖4?？梢钥闯?隨著降解時(shí)間的增加,纖維素的含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在第15 d時(shí)雞糞發(fā)酵組的纖維素含量最低,降至33.1%(降解率可達(dá)31.6%),其次為土壤降解組,可降至33.6%。

圖 4 單組份菌劑降解落葉混合物過程中纖維素含量的變化

Fig.4 The change of cellulose content during fallen

leaves degrading by single inoculants

綜上結(jié)果表明,單菌劑實(shí)驗(yàn)中,添加雞糞菌劑的降解效果最佳。原因是雞糞中含有豐富的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)含量較高時(shí),其中所含的氮元素含量也較其他菌劑高,使其發(fā)酵初始的C/N比較低,較低的C/N比有利于原料中纖維素的降解。

2.3 雙組份菌劑降解過程中各成分測(cè)定

2.3.1 總有機(jī)碳的降解 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中總有機(jī)碳的變化見圖5?？梢钥闯?落葉中的總有機(jī)碳含量整體呈下降趨勢(shì),且發(fā)酵前期變化迅速,后期變化逐漸緩慢。分析認(rèn)為發(fā)酵初期微生物活動(dòng)較后期更為活躍,因此表現(xiàn)出發(fā)酵前期總有機(jī)碳的含量迅速下降。在發(fā)酵第15天時(shí),雞糞+菌液降解組的總有機(jī)碳利用率最高,含量降至24.88%,其次為土壤+雞糞降解組,總有機(jī)碳含量降至26.53%。

圖 5 雙組份菌劑降解落葉過程中總有機(jī)碳的變化Fig.5 The change of TOC during fallen leaves degrading by double inoculants

2.3.2 總氮的降解 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中總氮的變化見圖6?？梢钥闯? 原料中在加入不同微生物菌劑后,不同降解處理中總氮含量出現(xiàn)差異。隨著降解時(shí)間延長,其中總氮含量整體呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì),添加剩余污泥+土壤菌劑的降解組,在第15天時(shí)總氮含量最高,達(dá)到 1.64%。所有處理的最終物料總氮含量均高于原料,是由于降解使總體積和質(zhì)量均有下降,導(dǎo)致后期總氮含量的上升。

圖 6 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中總氮的變化Fig.6 The change of TN during fallen leaves degrading by double inoculants

2.3.3 C/N的變化 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中C/N的變化見圖7?？梢钥闯?降解過程中,C/N總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且變化幅度較大。第9天左右,雞糞+土壤降解組對(duì)原料C/N的降解就可達(dá)到20以下,表示處于腐熟狀態(tài),其余的菌劑在降解時(shí)間延長至12 d之后,可以降至C/N均小于20。

2.3.4 纖維素的降解 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中纖維素含量的變化見圖8?？梢钥闯?隨著降解時(shí)間的延長,纖維素的含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在第15天時(shí)雞糞+土壤降解組的纖維素含量降至33.4%(降解率31.0%),其次為污泥+雞糞降解組的纖維素含量,可降至33.8%,均低于加入單組份雞糞菌劑的降解效果,說明加入雙組分菌劑不利于纖維素的降解,因?yàn)榫N過多,相互之間對(duì)營養(yǎng)物或環(huán)境條件會(huì)存在競爭抑制作用[23]。

圖 8 雙組份菌劑降解落葉過程中纖維素的變化Fig.8 The change of cellulose content during fallen leaves degrading by double inoculants

綜上所述,雙組份菌劑實(shí)驗(yàn)中添加雞糞+土壤組菌劑的物質(zhì)降解效果總體最佳。原因是雞糞中含有豐富的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)含量較高時(shí),其中所含的總氮量也較其他菌劑高,使其降解初始的C/N較低,較低的C/N有利于原料中纖維素的降解;同時(shí)土壤中富含降解落葉的菌種,對(duì)于纖維素的降解效果較污泥、豬糞更佳;但比較而言,由于菌種之間競爭抑制的緣故,單組分菌劑雞糞對(duì)纖維素的降解效果反而更加有效。

2.4 優(yōu)勢(shì)菌落的分離和觀察

選取不同菌劑與落葉混合降解15 d的產(chǎn)物為菌種來源,利用剛果紅選擇培養(yǎng)基在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。通過觀察不同稀釋梯度平板中的微生物菌落,發(fā)現(xiàn)10-6倍稀釋梯度平板中的微生物數(shù)量及種類分布較為均勻,菌落獨(dú)立不重疊。因此,真菌和細(xì)菌的分離從10-6倍的稀釋梯度平板中挑選并進(jìn)行分離培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果如圖9所示。

(a) 豬糞 (b) 土壤

(c) 剩余污泥 (d) 雞糞圖 9 不同菌劑中纖維素降解菌的培養(yǎng)

Fig.9 Culture of cellulose degrading microorganisms in different microbial inoculants

觀察菌落是否產(chǎn)生透明圈及其大小。透明圈數(shù)量越多,面積越大則表示該菌種對(duì)纖維素的降解效果越好。從圖9可以看出,雞糞降解組的菌種形成的透明圈個(gè)數(shù)最多最明顯,說明雞糞菌種中纖維素降解菌對(duì)纖維素的降解效果最好。

2.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定

從前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,無論是單一菌劑,還是雙組分菌劑,都表明雞糞中含有的纖維素降解菌是比較有效的。因此,通過對(duì)雞糞中分離出來的纖維素降解菌純化培養(yǎng),并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,了解落葉中纖維素的高效降解菌種所屬,為纖維素高效降解菌種的選擇和擴(kuò)大培養(yǎng)提供目標(biāo),以期為綠化廢棄物堆肥提供優(yōu)勢(shì)微生物菌種。

2.5.1 菌株 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果 圖10為菌株的ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖中M為DL5000 DNA Marker; 1,2為菌株P(guān)CR產(chǎn)物；3，4為陰性對(duì)照。圖中顯示陰性對(duì)照組無條帶,而目的菌株的電泳條帶在500～750 bp之間,與目的條帶大小一致。表明菌株的ITS區(qū)擴(kuò)增正確,可進(jìn)行測(cè)序。

圖 10 菌株的ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.10 Electrophoresis of PCR amplified products in ITS region of strain

2.5.2 菌株的序列分析 經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序得到長度為530 bp的核苷酸序列,提交Blast,與NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,結(jié)果表明相似性可達(dá)到99%以上,再運(yùn)用MEGA5.0軟件包選用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22],確定該菌株為橘青霉屬(penicilliumcitrinum)。

橘青霉具有易培養(yǎng)和生長快的優(yōu)勢(shì),可借助菌絲的生長作用大面積插入堆體,利用分泌的胞外水解酶如纖維素酶,對(duì)纖維素等有機(jī)物進(jìn)行降解。在綠化廢棄物堆肥過程中,可借助添加纖維素高效降解菌縮短堆肥周期,提高堆肥效率。因此,橘青霉是一種有重要應(yīng)用潛力的纖維素分解菌。

3 結(jié)論

1) 單組份雞糞菌劑降解實(shí)驗(yàn)、雙組份菌劑降解實(shí)驗(yàn)和菌落透明圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示雞糞菌種中纖維素降解菌對(duì)纖維素的降解效果最佳。

2) 以雞糞菌劑與落葉混合降解15 d的產(chǎn)物為菌種來源,篩選和分離出纖維素高效降解菌種,菌種鑒定結(jié)果為橘青霉屬(penicilliumcitrinum),具有作為高效堆肥菌的可行性和價(jià)值。