制川烏高壓蒸法炮制工藝優(yōu)化研究

馬恩耀 羅文英 周勁松

摘要 [目的]對制川烏高壓蒸法炮制工藝進行優(yōu)化研究。[方法]選取影響制川烏質量的關鍵工藝步驟進行單因素試驗，根據單因素考察的結果進行正交試驗，以雙酯型生物堿總量、單酯型生物堿總量為考察指標，得到最佳炮制工藝，并進行驗證性試驗。[結果]制川烏最佳炮制工藝為清水浸泡6 h，高壓蒸制60 min，切片，60 ℃烘干。[結論]該研究為制川烏炮制工藝的規(guī)范化、質量標準的提高以及臨床用藥質量的保障提供參考。

關鍵詞 制川烏;高壓蒸法;炮制工藝;優(yōu)化;雙酯型生物堿;單酯型生物堿

中圖分類號 R283 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0172-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.048

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Abstract [Objective]The research aimed to optimize the high pressure steaming processing technology of Aconiti Radix Cocta.[Method]The key process steps that affect the quality of Aconiti Radix Cocta were selected for singlefactor tests， and orthogonal tests were performed based on the results of singlefactor investigations. The total amount of diester alkaloids and the total amount of monoester alkaloids were used as indicators to obtain the best processing technology and carry out confirmatory tests.[Result]The best processing technology of Aconiti Radix Cocta was soaking for 6 h， steaming at highpressure for 6 min， cuting into slices， drying at 60 ℃. [Conclusion]The study provides experimental reference for the standardization of the processing technology， the improvement of the quality standard and the quality assurance of clinical drug use，

Key words Aconiti Radix Cocta;High pressure steaming method;Processing technology;Optimizations;Diester alkaloids;Monoester alkaloids

川烏是一種常用中藥，為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根，其商品主要是栽培品，是較為重要的藥用農業(yè)經濟作物。川烏藥用歷史悠久，《神農本草經》即有記載;其味辛、苦、性熱，具有祛風除濕、溫經止痛的功能，用于風寒濕痹、關節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛[1]。川烏臨床應用較廣，但因其有大毒，自古以來便需通過炮制，將其所含毒性強的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等雙酯類生物堿成分降解為毒性弱的苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿等單酯類生物堿成分，從而使毒性降低至適宜程度方予使用。歷代所用的川烏炮制方法眾多，如煨制、鹽制、黑豆蒸、水浸等，不下30種[2]。歷史上川烏炮制方法雖多，但新中國成立后，被《中國藥典》這一法定國家藥品標準收載的只有1種（即制川烏），其炮制方法為：取川烏，大小個分開，用水浸泡至內無干心，取出，加水煮沸4～6 h（或蒸6～8 h）至取大個及實心者切開內無白心，口嘗微有麻舌感時，取出，晾至六成干，切片，干燥[1]。有關制川烏炮制方法研究的論文已有一些[3-9]，其中亦有采用高壓蒸法，但或因采用的炮制過程與《中國藥典》存在差異，或因只進行了單因素考察，故都存在一些不適合飲片生產企業(yè)工業(yè)化生產的情況。筆者從法規(guī)依從性出發(fā)，完全遵循《中國藥典》規(guī)定的炮制方法，并結合企業(yè)實際生產條件，對制川烏高壓蒸法炮制工藝進行研究，明確了關鍵工藝參數(shù)并達到了工業(yè)化生產的要求，確保了制川烏產品質量的均一、穩(wěn)定、可控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。BSA225S-CW分析天平（德國賽多利斯集團）;DMF-4B手提式高速中藥粉碎機（浙江溫嶺市銘大藥材機械設備有限公司）;GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;KSW型電阻爐溫度控制器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;RV10控制型立式旋轉蒸發(fā)儀[艾卡（廣州）儀器設備有限公司];KQ-300DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;YXQ-LS-18SI壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;UltiMate 3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.1.2 試材。川烏藥材產于四川江油，經廣州中醫(yī)藥大學高明副教授鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根;經檢驗其雙酯型生物堿含量（即烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的總量）為0.064%、水分9.7%、總灰分7.0%、酸不溶性灰分1.2%，均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。

1.1.3 主要試劑。異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水，AR，均購自廣州化學試劑廠;烏頭堿（批號110720-201111）、次烏頭堿（批號110798-201308）、新烏頭堿（批號110799-201608）、苯甲酰烏頭原堿（批號111794-201102）、苯甲酰次烏頭原堿（批號111796-201303）、苯甲酰新烏頭原堿（批號111795-201303），均購自中國藥品生物制品檢定研究所。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。取苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品、烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品及新烏頭堿對照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1 mL含苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿各50 μg、苯甲酰新烏頭原堿0.3 mg的混合溶液及每1 mL含烏頭堿50 μg、次烏頭堿和新烏頭堿各0.15 mg的混合溶液，即得[10-12]。

1.2.2 供試品溶液的制備。取制川烏粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz;水溫在25 ℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得[10-12]。

1.2.3 色譜分析條件。色譜柱：資生堂Superiorex ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-四氫呋喃（25∶15）（A）-0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL）（B），梯度洗脫（0～48 min，15%～26% A;48～49 min，26%～35% A;49～58 min，35% A;58～65 min，35%～15% A）;流速0.8 mL/min;檢測波長235 nm;柱溫27 ℃;進樣量10 μL。理論板數(shù)按苯甲酰新烏頭原堿峰計算應不低于2 000。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1 線性關系的考察。取“1.2.1”項下的對照品溶液，分別按照“1.2.3”方法進樣2、4、6、10、15、20 μL，記錄色譜圖，以進樣濃度X（μg/mL）為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗。取按“1.2.2”方法制備的供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜分析條件分別于0、2、4、6、8 h進樣，進樣量10 μL，測定烏頭堿等6個物質的峰面積積分值，計算RSD。

1.2.4.3 精密度試驗。取按“1.2.1”方法制備的對照品溶液，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進樣6次，計算烏頭堿等6個物質峰面積的RSD值。

1.2.4.4 重復性試驗。取按“1.2.2”方法制備的供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜分析條件進樣，進樣量為10 μL，測定烏頭堿等6個物質的峰面積，計算RSD。

1.2.4.5 加樣回收試驗。取按“1.2.2”方法制備的供試品溶液6份，精密稱量，測定其樣品所含單酯型生物堿含量，分別加入苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對照品溶液各1 mL，按“1.2.2”方法制備成供試品溶液，測定3種單酯型生物堿含量，并計算回收率和RSD。

1.2.5 樣品的含量測定。按“1.2.2”方法分別精密稱取制川烏飲片粉末配制成供試品溶液各2份，按“1.2.3”方法對樣品進行含量測定，計算得出雙酯型生物堿、單酯型生物堿含量。

1.2.6 單因素試驗。

1.2.6.1 浸泡時間。取川烏藥材4份（每份約1 000 g），分別置于適宜容器中，用水分別浸泡6、12、18、24 h，取出，置蒸制容器內120 ℃高壓蒸制60 min后取出，切片，60 ℃烘干。按“1.2.5”方法對樣品進行含量測定。

1.2.6.2 蒸制時間。取川烏藥材3份（每份約1 000 g），分別置于適宜容器中，用水分別浸泡6 h后取出，置蒸制容器內分別在120 ℃高壓蒸制30、60、90 min后取出，切片，60 ℃烘干。按“1.2.5”方法對樣品進行含量測定。

1.2.6.3 干燥溫度。取川烏藥材4份（每份約1 000 g），分別置于適宜容器中，用水分別浸泡6 h，取出，置蒸制容器內120 ℃高壓蒸制60 min后取出，切片，分別在40、50、60、70 ℃下烘干。按“1.2.5”方法對樣品進行含量測定。

1.2.7 正交試驗。根據上述對工藝的單因素考察，選取影響比較大的3個因素進行正交考察。以浸泡時間、蒸制時間和干燥溫度為考察因素，以雙酯型生物堿總量、單酯型生物堿總量為指標，按L9（3.4）正交表安排試驗，對制川烏的工藝進行正交優(yōu)化。

1.2.8 驗證試驗。按上述正交優(yōu)化工藝得到的最佳工藝進行3次驗證試驗，每次投料凈川烏飲片10 kg，分別取樣測定并計算含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系的考察。按“1.2.4.1”方法操作，以進樣濃度X（μg/mL）為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算得線性方程分別為苯甲酰烏頭堿Y=0.032 8X+0.000 2（R.2=0.999 1）、苯甲酰次烏頭堿Y=0.016 3X+0.000 1（R.2=0.999 7）、苯甲酰新烏頭堿Y=0.043 8X+0.005 2（R.2=0.999 6），表明3種單酯型生物堿在對應含量范圍內有良好的線性關系;烏頭堿回歸方程為Y=0.026 6X-0.005 4（R.2=0.999 2），次烏頭堿回歸方程為Y=0.037 2X-0.005 9（R.2=0.999 7），新烏頭堿的回歸方程為Y=0.035 8X+0.005 8（R.2=0.999 5）。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗。按“1.2.4.2”方法操作，測得烏頭堿等6個物質的峰面積的RSD為0.65%～1.34%，表明樣品在8 h內性質穩(wěn)定。

2.1.3 精密度試驗。按“1.2.4.3”方法操作，計算得峰面積的RSD為0.57%～1.12%，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.1.4 重復性試驗。按“1.2.4.4”方法操作，計算得RSD為0.83%～1.41%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收試驗。按照“1.2.4.5”方法操作，計算出苯甲酰烏頭原堿的加樣回收率為95.6%，RSD為0.88%;苯甲酰次烏頭原堿的加樣回收率為98.3%，RSD為0.72%;苯甲酰新烏頭原堿的加樣回收率為97.1%，RSD為1.07%;烏頭原堿的加樣回收率為100.2%，RSD為0.98%;次烏頭原堿的加樣回收率為94.6%，RSD為1.02%;新烏頭原堿的加樣回收率為98.1%，RSD為0.84%，表明含量測定的方法穩(wěn)定可靠，可用于制川烏的含量檢測。

2.2 單因素試驗

2.2.1 浸泡時間。按“1.2.6.1”方法操作，計算得出不同浸泡時間條件下制川烏的含量，測定結果如表1所示。

由表1可知，浸泡6 h時，單酯型生物堿總量最高，且隨著浸泡時間的增加，單酯型生物堿總量減少。

2.2.2 蒸制時間。按“1.2.6.2”方法操作，計算得出不同蒸制時間條件下制川烏的含量，測定結果如表2所示。由表2可知，高壓蒸制60 min時，單酯型生物堿總量最高。

2.2.3 干燥溫度。按“1.2.6.3”方法操作，計算得出不同干燥溫度條件下制川烏的含量，測定結果如表3所示。

由表3可知，60 ℃干燥時，單酯型生物堿總量最高。

2.3 正交試驗 按“1.2.7”方法操作，因素水平見表4，正交試驗設計見表5。

從表5可以看出，以雙酯型生物堿總量為指標時，各影響因素均無顯著性;以單酯型生物堿總量為指標時，蒸制時間具有顯著性;無論是以雙酯型生物堿總量還是以單酯型生物堿總量為指標，均是蒸制時間的R值最大，且明顯高于其他2個影響因素。從極差分析結果可以看出，以雙酯型生物堿總量為指標時，各影響因素不同水平的順序為A1>A2>A3，B2=B3>B1，C2=C3>C1;以單酯型生物堿總量為指標時，各影響因素不同水平的順序為A1>A3>A2，B2>B1>B3，C2>C3>C1;二者雖有不同，但A1、B2、C2均為相應影響因素各水平中最大者。綜合分析考慮，確定制川烏的最佳炮制工藝為A1B2C2，即浸泡6 h，蒸制60 min，在60 ℃溫度下烘干。

2.4 驗證試驗 按“1.2.8”方法操作，計算同一炮制方法下3個批次的制川烏含量，測定結果見表6。

3 結論與討論

結合生產實際，該研究選取浸泡時間、蒸制時間、干燥溫度這3個因素進行單因素考察，并進一步挑選這3個因素不同水平，對制川烏炮制工藝進行正交試驗。在車間的實際生產工藝中，水浸天數(shù)在6～24 h，故水浸時間初步確定在6、12、18 h 3個水平上。在考慮節(jié)省原料及可行性上，確定高壓蒸制時間為30、60、90 min。參考藥典及其他文獻，選擇50、60、70 ℃作為干燥溫度的3個水平。結果表明，制川烏的最佳炮制工藝為：清水浸泡6 h，高溫蒸制60 min，60 ℃烘干。驗證結果表明，經該方法炮制后，雙酯型生物堿的含量未超過限量，單酯型生物堿含量高于生品，其他檢測項目均符合藥典標準，可見該炮制方法有利于川烏的減毒增效。依據該研究方法進行進一步驗證，制川烏的品質得以提升，同時為大規(guī)模生產提供了理論基礎和依據。

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