旱黃瓜未授粉子房雌核誘導(dǎo)技術(shù)體系研究

郭曉雨 宋曉飛 李曉麗

摘要 以4種不同基因型旱黃瓜的未授粉子房為試材，研究了基因型、子房不同發(fā)育時(shí)期及采樣時(shí)間、不同質(zhì)量濃度的 TDZ、溫度對(duì)雌核誘導(dǎo)的影響，旨在探究旱黃瓜未授粉子房誘導(dǎo)雌核發(fā)育的技術(shù)體系。結(jié)果表明，不同基因型對(duì)雌核發(fā)育的影響差異顯著，“1503”的雌核啟動(dòng)率最高，為77.22%;開(kāi)花前1 d的樣品最優(yōu)，此時(shí)1503雌核啟動(dòng)率為95.56%;隨TDZ質(zhì)量濃度上升，雌核啟動(dòng)率呈先上升后下降趨勢(shì)，其中0.08 mg/L TDZ處理的1503雌核啟動(dòng)率最高，達(dá)91.6%;35 ℃暗培養(yǎng)4 d的處理，雌核啟動(dòng)率最優(yōu)，達(dá)78.33%。旱黃瓜未授粉子房培養(yǎng)最優(yōu)雌核誘導(dǎo)技術(shù)體系：以開(kāi)花前1 d未授粉子房為材料，在添加0.08 mg/L TDZ的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行35 ℃ 暗培養(yǎng)4 d。該研究成功建立了旱黃瓜未授粉子房雌核誘導(dǎo)技術(shù)體系，為旱黃瓜遺傳育種及基礎(chǔ)理論研究提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 旱黃瓜;未授粉子房;雌核啟動(dòng)率

中圖分類(lèi)號(hào) S642.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）05-0051-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.015

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract The effects of genotype， ovary development stage and sampling time， TDZ treatment with different mass concentration， and temperature on esterium induction were studied in unpollinated ovary of cucumber.The results showed that there were significant differences in the effects of different genotypes on the development of the female nucleus.The sample was optimal 1 day before flowering， when the activation rate of the female nucleus of “1503” was 95.56%.With the increase of TDZ mass concentration， the activation rate of female nucleus increased first and then decreased， among which the activation rate of 1503 female nucleus treated with 0.08mg /L TDZ was the highest， up to 91.6%.After dark culture at 35 ℃ for 4 days， the activation rate of female nucleus was the best， up to 78.33%.In this study， the optimal estrus induction technology system for the culture of unpollinated ovary of drought cucumber was as follows： the unpollinated ovary was taken as the material 1 day before flowering， and dark culture was conducted at 35 ℃ for 4 days on the induction medium supplemented with 0.08 mg/L TDZ.In this study， the technology system of ovum estrogennucleus induction in unpollinated ovary of drought cucumber was preliminarily explored， which provided technical support for the genetic breeding and basic theoretical research of drought cucumber.

Key words Drought cucumber;Nonpollination ovary;Female nuclear initiation rate

黃瓜（Cucumis sativus L.）為重要的蔬菜作物，北方旱黃瓜屬于華南型黃瓜[1]。我國(guó)環(huán)渤海灣地區(qū)和東北三省是旱黃瓜主作區(qū)和消費(fèi)區(qū)。在黃瓜常規(guī)雜交育種中，雜交后代自交系的純合往往需要5～7年，而利用未授粉子房培養(yǎng)快速獲得純系是加速黃瓜育種的有效途徑[2-3]。San Noeum等[4]在大麥離體培養(yǎng)研究中首次提出“雌核發(fā)育”一詞。雌核發(fā)育誘導(dǎo)受基因型、取樣時(shí)期、培養(yǎng)條件、外源激素等因素影響。Shalaby[5]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南瓜的胚發(fā)生率為48%。李偉[6]發(fā)現(xiàn)，西葫蘆的胚誘導(dǎo)率為18.7%。在黃瓜上，劉立功等[7]以7種基因型為材料，研究發(fā)現(xiàn)不同基因型出胚率差異較大，最高出胚個(gè)數(shù)為25.3個(gè)，最低僅為0.7個(gè)。裴曉利等[8]以9種基因型為試材，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“津優(yōu)38”雌核啟動(dòng)率最高，為92.33%。研究表明，西葫蘆、南瓜等以雌花開(kāi)花當(dāng)天的未授粉子房為材料，培養(yǎng)效果最好[9-10]。

在暗培養(yǎng)的時(shí)間和溫度等因素上，也有較多研究。在黃瓜上，25 ℃暗培養(yǎng)1 d的未授粉子房雌核啟動(dòng)率最高為91.3%，噻苯?。═hidiazuron，TDZ）有助于雌核發(fā)育[11-12]。在西葫蘆上，熱激處理5 d效果較佳[13]。在南瓜上，35 ℃處理下的未授粉子房胚發(fā)生率最高，達(dá)32.2%[14]。TDZ濃度也是影響雌核發(fā)育的重要因素，在TDZ濃度方面，在黃瓜離體雌核研究中，TDZ濃度為0.08 mg/L時(shí)雌核啟動(dòng)率最高，為93.1%[11];在甜瓜離體培養(yǎng)中，以TDZ濃度0.02 mg/L時(shí)雌核啟動(dòng)率最高，為65.8%[15];在西瓜中，以0.08 mg/L TDZ處理的反應(yīng)率為最佳[16]。為此，筆者通過(guò)選擇基因型、子房不同發(fā)育時(shí)期、不同質(zhì)量濃度的 TDZ、不同暗培養(yǎng)處理溫度，研究提高黃瓜全雌性雌核啟動(dòng)率，以期提高黃瓜雜交育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料由河北科技師范學(xué)院黃瓜課題組提供，以華南型全雌旱黃瓜雜種一代的“1501”“1502”“1503”“1504”。

1.2 試驗(yàn)方法

在植株開(kāi)花前1 d 用鑷子取雌花節(jié)15～30 節(jié)、長(zhǎng)度2.0～2.2 cm 未授粉子房為外植體，流水沖洗30 min，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖2 次，再用質(zhì)量濃度0.1 g/L的 HgCl2溶液浸泡6 min，無(wú)菌水沖洗4～5 次，每次2 min，無(wú)菌濾紙吸凈表面的水分，用解剖刀去掉外植體花冠及瓜把，留取中間部分，剝?nèi)ネ庵搀w表皮，切成1.0 mm厚的薄片，可明顯看見(jiàn)子房。各個(gè)試驗(yàn)處理的外植體（3次重復(fù)，每次重復(fù)60片，總計(jì)180片）均接種至培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠，pH 5.7，高溫滅菌 20 min）中，接種后于光照度 2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d，電熱恒溫培養(yǎng)箱25 ℃暗培養(yǎng)5 d。

1.3 旱黃瓜未授粉子房雌核發(fā)育誘導(dǎo)設(shè)計(jì)

（1）不同基因型。取開(kāi)花前1 d 的1501、1502、1503、1504為試材接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠+0.08 mg/L TDZ，pH 5.7），35 ℃暗培養(yǎng)5 d。

（2）子房不同發(fā)育時(shí)期及采樣時(shí)間。①子房不同發(fā)育時(shí)期，調(diào)查開(kāi)花前1、2、3、4、5 d和開(kāi)花當(dāng)天子房長(zhǎng)度及花冠形態(tài);②采樣時(shí)間，以1501、1502、1503、1504為試材，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠+0.08 mg/L TDZ，pH 5.7）中，25 ℃暗培養(yǎng)5 d。

（3）不同質(zhì)量濃度的 TDZ處理。以1501、1502、1503、1504為試材，將子房切片分別培養(yǎng)在含0、0.06、0.08、0.10 mg/L TDZ的培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠 ?pH 5.7）中，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱 25 ℃暗培養(yǎng) 5 d。

（4）不同溫度。以1501、1502、1503、1504為試材，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠+0.08 mg/L TDZ， pH 5.7）中，于 25、30、35、37 ℃暗箱培養(yǎng)處理 5 d。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

子房薄片培養(yǎng)7 d后，每1 d調(diào)查1次胚發(fā)生數(shù)（以有類(lèi)似球形胚結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的子房塊計(jì)數(shù)），共調(diào)查3次，雌核啟動(dòng)率=每處理子房切片總數(shù)/有胚發(fā)生子房塊數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 DPS軟件（2008.01.15/版本）和 Excel 2016 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對(duì)旱黃瓜未授粉子房雌核啟動(dòng)率的影響

35 ℃暗培養(yǎng)5 d，5種不同基因型的雌核啟動(dòng)率有明顯差異（表1）。1503的雌核啟動(dòng)率達(dá)顯著水平，為 77.22%;1504的雌核啟動(dòng)率最低，為48.33%。通過(guò)人工誘導(dǎo)培養(yǎng)的外植體其雌核啟動(dòng)率與不處理的外植體雌核啟動(dòng)率有顯著差異。

2.2 子房不同發(fā)育時(shí)期及采樣時(shí)間對(duì)旱黃瓜未授粉子房雌核啟動(dòng)率的影響

結(jié)果表明，子房不同發(fā)育時(shí)期其子房長(zhǎng)度、花冠形態(tài)和及采樣時(shí)間雌核啟動(dòng)率表現(xiàn)不同。在植株開(kāi)花盛期，取15～30節(jié)開(kāi)花前1 d的未授粉子房，其長(zhǎng)度為2.0～2.2 cm（表2），花冠呈黃綠色緊閉狀態(tài)（圖1 E）。1503開(kāi)花前1 d的雌核啟動(dòng)率達(dá)顯著水平，達(dá)95.56%（表3）。

2.3 不同濃度的TDZ對(duì)旱黃瓜未授粉子房雌核啟動(dòng)率的影響

研究不同質(zhì)量濃度的 TDZ 對(duì)4種基因型雌核啟動(dòng)率的影響。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的 TDZ在0、0.06、0.08、0.10 mg/L 中，1503的雌核啟動(dòng)率在TDZ質(zhì)量濃度 0.08 mg/L時(shí)最高，達(dá)91.67%;比TDZ質(zhì)量濃度 0.00 mg/L時(shí)的雌核啟動(dòng)率高85.19百分點(diǎn)。雌核啟動(dòng)率最低的是 1502，在 TDZ質(zhì)量濃度 0.00 mg/L時(shí)僅為 3.70%（表4）。

2.4 不同溫度對(duì)旱黃瓜未授粉子房雌核啟動(dòng)率的影響

將4種不同材料在25、30、35、37 ℃下進(jìn)行暗培養(yǎng)5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1503在35 ℃下暗培養(yǎng)4 d時(shí)，雌核啟動(dòng)率最高達(dá)78.33%（表5）。培養(yǎng)2 d時(shí)，切片可見(jiàn)球型（雌核，黃白色），培養(yǎng)5 d后，呈淡綠色（圖2）。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同基因型對(duì)雌核啟動(dòng)率的影響

研究表明基因型是西葫蘆雌核發(fā)育的影響因素[6];杜勝利等[17]首次在研究黃瓜離體雌核發(fā)育的影響因素中發(fā)現(xiàn)了基因型對(duì)黃瓜雌核發(fā)育有影響;在離體雌核培養(yǎng)中基因型是影響胚發(fā)育的重要因素之一，該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在離體雌核培養(yǎng)中經(jīng)過(guò)處理的不同基因型其雌核啟動(dòng)率有明顯差異，進(jìn)而證實(shí)基因型是影響雌核發(fā)育的因素。

3.2 子房不同發(fā)育時(shí)期及采樣時(shí)間對(duì)雌核啟動(dòng)率的影響

子房發(fā)育時(shí)期對(duì)雌核發(fā)育有一定的影響。黃瓜只能從雌配子體晚期或成熟胚囊期的胚珠與子房培養(yǎng)誘導(dǎo)孤雌生殖。外植體的接種時(shí)期可能比培養(yǎng)基成分更為重要[18]。研究甜瓜離體雌核發(fā)育開(kāi)花前1 d子房培養(yǎng)效果最好[19]，這與該試驗(yàn)結(jié)果基本一致;在子房發(fā)育時(shí)期的研究表明取開(kāi)花前1 d效果最好，胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)83.3%[6];而同其他研究有較小差異，認(rèn)為未授粉子房開(kāi)花前2～3 d的胚誘導(dǎo)率最高，其原因可能是不同基因型、不同培養(yǎng)條件導(dǎo)致[20]。該試驗(yàn)在植株開(kāi)花盛期取15～30節(jié)開(kāi)花前1 d的未授粉子房的雌核發(fā)育最高。

3.3 不同質(zhì)量濃度的TDZ對(duì)雌核啟動(dòng)率的影響

TDZ濃度對(duì)啟動(dòng)雌核發(fā)育具有一定的誘導(dǎo)效果。TDZ具有類(lèi)細(xì)胞分裂素的活性，促進(jìn)植物體內(nèi)類(lèi)生長(zhǎng)素物質(zhì)合成的作用[21];研究表明0.06 mg/L時(shí)胚狀體誘導(dǎo)率最高為66.7%[22];但也有研究TDZ的使用對(duì)雌核發(fā)育有誘導(dǎo)影響，且濃度在0.04 mg/L時(shí)胚發(fā)生率最大[20];裴曉利等[8]在研究黃瓜離體雌核發(fā)育中發(fā)現(xiàn)濃度以0.08 mg/L時(shí)雌核啟動(dòng)率為93.1%;而該試驗(yàn)僅對(duì)TDZ一種外源激素進(jìn)行了研究，在0、0.06、0.080和0.10 mg/L的處理中得出TDZ 0.08 mg/L 對(duì)雌核發(fā)育有較大影響，達(dá)91.67%。

3.4 不同溫度對(duì)雌核啟動(dòng)率的影響

在南瓜未受精子房研究上表明暗培養(yǎng)35 ℃條件下5 d培養(yǎng)效果最好[23];在35 ℃ 暗培養(yǎng)3 d的反應(yīng)率效果較好[24]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)35 ℃暗培養(yǎng)4 d時(shí)，雌核啟動(dòng)率最高。進(jìn)一步說(shuō)明35 ℃利于旱黃瓜雌核啟動(dòng)率的發(fā)生。與前人研究有所差異，可能與基因型有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)基因型、子房不同發(fā)育時(shí)期、不同質(zhì)量濃度的 TDZ、不同溫度暗培養(yǎng)的旱黃瓜雌核誘導(dǎo)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，試材1503的雌核啟動(dòng)率明顯高于1501、1502、1504 3種試材，進(jìn)而證實(shí)基因型、子房不同發(fā)育時(shí)期、不同質(zhì)量濃度的 TDZ，不同溫度是影響雌核發(fā)育的因素。該試驗(yàn)結(jié)果表明，取植株開(kāi)花盛期15～30節(jié)開(kāi)花前1 d的未授粉子房，花冠緊閉，呈黃綠色，2.0～2.2 cm的外植體接種到添加0.08 mg/L的培養(yǎng)基上，35 ℃暗培養(yǎng)4 d利于旱黃瓜的雌核啟動(dòng)率的發(fā)生。但此技術(shù)在旱黃瓜的實(shí)踐應(yīng)用上還需深入研究。

雖然離體培養(yǎng)研究目前很受歡迎，但在實(shí)踐應(yīng)用上會(huì)受到多因素影響（環(huán)境條件，操作人員，場(chǎng)所等），操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易污染，建議工廠化管理應(yīng)用，如何大面積推廣應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

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