不同來(lái)源地骨皮藥材中地骨皮甲素和乙素及阿魏酸的含量測(cè)定分析

趙曉玲 ，張?chǎng)维?，何春年 ，彭 勇

(1．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193; 2．國(guó)家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

地骨皮為茄科植物枸杞 Lycium chinense Mill．或?qū)幭蔫坭絃ycium barbarum L．的干燥根皮，主產(chǎn)于山西、陜西、寧夏以及華北等地，味甘，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)[1]。地骨皮為常用中藥，具有涼血除蒸、清肺降火的功能，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血、內(nèi)熱消渴等癥[2]。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，對(duì)地骨皮進(jìn)行了一系列化學(xué)成分和藥理活性研究，發(fā)現(xiàn)其主要成分包括黃酮、有機(jī)酸、多肽類、甾醇、香豆素和揮發(fā)油等，藥理作用主要為降血壓、降血糖、解熱和鎮(zhèn)痛等。然而，迄今地骨皮有效成分尚不明確，《中國(guó)藥典》也沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)[3]。為了更好地控制地骨皮藥材質(zhì)量，本試驗(yàn)對(duì)地骨皮中有較明確藥理活性的地骨皮甲素/乙素和阿魏酸兩類化合物進(jìn)行含量測(cè)定研究。

地骨皮甲素和地骨皮乙素(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)屬于精胺生物堿。地骨皮甲素、乙素體外可以從源頭阻斷細(xì)胞的炎癥活化，避免免疫反應(yīng)紊亂，體內(nèi)可對(duì)脂多糖和CpG DNA發(fā)揮拮抗作用，因此地骨皮甲素、乙素是糾正免疫紊亂、發(fā)揮防止膿毒癥和自身免疫性疾病作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4];另外，還具有錐蟲基硫還原酶抑制[5]和細(xì)菌內(nèi)毒素拮抗[6]等活性。地骨皮甲素和乙素同時(shí)存在于中藥地骨皮中，是主要的降血壓有效成分[7];兩者系同分異構(gòu)體，在常規(guī)色譜條件下難以分離[8-9]。同時(shí)，兩者藥理活性均非常明顯，因此在本試驗(yàn)中作為同一指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

圖1 化學(xué)結(jié)構(gòu)式

阿魏酸(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)是植物中廣泛分布的一種芳香酸，具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羥色胺釋放、抑制血小板血栓素A2的生成[7]、增強(qiáng)前列腺素活性、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用[8]。因此，在本試驗(yàn)中采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)法同時(shí)測(cè)定了不同來(lái)源地骨皮藥材中地骨皮甲素、乙素和阿魏酸含量，比較分析其含量在該藥材中存在的一般規(guī)律，以期為該藥材的質(zhì)量控制、評(píng)價(jià)以及資源開(kāi)發(fā)利用等提供一定依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括 G1322A型在線脫氣機(jī)、G1311A型液相泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站;UV2550型紫外光譜儀(日本島津公司);AL204型梅特勒-托利多電子天平;DTC-21型ULVAC薄膜真空泵;C9860A型超聲波清洗器(上海杰恩普超聲設(shè)備有限公司)。色譜純?yōu)橐译?美國(guó)Honeywell B＆JACS公司)，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。地骨皮乙素對(duì)照品(批號(hào)為12021708)、阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100519)。地骨皮藥材包括筆者采集的來(lái)源于野生和栽培的品種及購(gòu)自全國(guó)各大藥店的樣品，經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所彭勇研究員鑒定為枸杞 Lycium chinense Mill．或?qū)幭蔫坭?L．barbarum L．的干燥根皮。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Synergi 4u Hydro-RP 80A柱(250 mm ×4．6 mm，4 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0．5%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～3 min時(shí) 10%A，3～10 min時(shí) 10% ～12%A，10～20 min時(shí)12% ～14%A，20～35 min時(shí) 14% ～15%A;流速:1．0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):278 nm;進(jìn)樣量:10 μL。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2．2 溶液制備

精密稱取地骨皮甲素對(duì)照品13．67 mg、地骨皮乙素對(duì)照品27．34 mg，阿魏酸對(duì)照品 2．30 mg，分別置 1，10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含地骨皮甲素13 670 μg、地骨皮乙素27 340 μg和阿魏酸230 μg的對(duì)照品溶液。取本品粉末約1．5 g，精密稱定，置30 mL西林瓶中，加甲醇15 mL，冷浸1 h，40℃超聲處理1 h，靜置，放冷至室溫，濾過(guò)，用10 mL甲醇分2次洗滌殘?jiān)^(guò)濾，合并兩次濾液，蒸干;殘留物用甲醇分次溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，并定容置刻度，搖勻，過(guò)0．45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取地骨皮乙素對(duì)照品溶液，將其依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為 27 340．0，13 670．0，1 367．0，273．4，136．7 μg/mL，將阿魏酸對(duì)照品溶液依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為230．0，57．5，23．0，11．5，4．6 μg/mL，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，地骨皮乙素為 Y=2．462 2X-329．607 3，r2=0．999 5(n=5)，阿魏酸為 Y=23．5955X-5．8775，r2=1．0000(n=5)。結(jié)果表明，地骨皮乙素與阿魏酸質(zhì)量濃度線性范圍分別為136．7～27340μg/mL和 4．6 ～230 μg/mL。

精密度試驗(yàn):精密吸取供試品(32號(hào)樣品)溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果地骨皮乙素與阿魏酸峰面積積分值的 RSD分別為0．54%和0．92%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取32號(hào)地骨皮樣品粉末1．5 g，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件檢測(cè)。結(jié)果地骨皮乙素和阿魏酸峰面積積分值的 RSD分別為1．61%和1．05%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取供試品(32號(hào)樣品)溶液，室溫下，分別于制樣后 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果地骨皮乙素和阿魏酸峰面積的 RSD分別為 0．65% 和2．23%(n=6)，表明供試品溶液中地骨皮乙素和阿魏酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的32號(hào)地骨皮樣品各9份，每份約1．5 g，精密稱定，分別加入定量地骨皮乙素和阿魏酸對(duì)照品，依法制備供試品溶液，測(cè)定樣品中地骨皮乙素和阿魏酸含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2．4 樣品含量測(cè)定

精密吸取各批次供試品溶液10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中地骨皮乙素和阿魏酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，在野生的8個(gè) L．chinense樣品中，山西、陜西和寧夏的樣品1，2，3，5，6 號(hào)中地骨皮乙素含量較高，均不低于 8．969 mg/g，但阿魏酸含量不一，含量最低值8．602 μg/g出現(xiàn)在5號(hào)的山西樣品中;在3個(gè)栽培的 L．barbarum樣品中，地骨皮乙素的含量均相對(duì)較高，介于9．090～15．026 mg/g，而阿魏酸含量則處于中等偏下水平，均小于11．292 μg/g;在市售的33個(gè)樣品中，產(chǎn)地為安徽、內(nèi)蒙古和湖南的 12，13，14，33，34，41，42 號(hào)樣品中地骨皮乙素的含量均在1 mg/g以下，含量相對(duì)較低，呈現(xiàn)了一定的地域規(guī)律，除兩個(gè)北方的內(nèi)蒙樣品外，其他均為南方購(gòu)買藥材，而阿魏酸含量則介于 10．208 ～34．336 μg/g，無(wú)明顯的地域差異。分析L．chinense和 L．barbarum這兩個(gè)種間的地骨皮乙素和阿魏酸含量，L．chinense中地骨皮乙素的含量相對(duì)偏高，除了上述提到的地域差別外，只有17，20，25號(hào)樣品中地骨皮乙素含量低于5 mg/g;而 L．barbarum中除38號(hào)樣品地骨皮乙素的含量為8．609 mg/g外，其他樣品的含量均低于5．021 mg/g，兩個(gè)種間阿魏酸含量的4 個(gè)最高值都出現(xiàn)在 L．chinense樣品中，分別是 27，32，36，37 號(hào)樣品。

表2 樣品中阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本試驗(yàn)采用了不同比例的甲醇、乙醇為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，發(fā)現(xiàn)甲醇提取的粗提物中雜質(zhì)峰相對(duì)較少;考察了不同流動(dòng)相及添加酸水種類，發(fā)現(xiàn)以乙腈和含0．5%三氟乙酸作為流動(dòng)相檢測(cè)，地骨皮乙素和阿魏酸色譜峰分離度好，無(wú)干擾，因此選擇乙腈-0．5%三氟乙酸水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。此外，本試驗(yàn)也比較了不同檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在278 nm波長(zhǎng)處地骨皮乙素具有最大吸收，同時(shí)阿魏酸也有較好的分離度且峰形較好，可較準(zhǔn)確地測(cè)定含量，因此選擇278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[10]。

本試驗(yàn)測(cè)定的地骨皮甲素、乙素和阿魏酸各有其特有的生物活性。地骨皮甲素是錐蟲基硫還原酶的有效抑制劑[4]，地骨皮乙素是一種新型的天然抗敗血癥劑[11]，且兩者在地骨皮中的含量較大;而阿魏酸作為一種化感物質(zhì)，在根內(nèi)可以表現(xiàn)出抑制競(jìng)爭(zhēng)性植物生長(zhǎng)的作用[12]，在枸杞栽培的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一定的影響。此外，地骨皮甲素和乙素兩者系同分異構(gòu)體，紫外檢測(cè)條件下在同一保留時(shí)間出峰(見(jiàn)圖2)[8-9]。鑒于此，本試驗(yàn)在前期準(zhǔn)備中利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算相同條件下兩者的摩爾吸光系數(shù) ε，分別為 1．69 ×105L/(mol·cm)和 1．68 ×105L/(mol·cm)，兩者差別不大。如圖2所示，在購(gòu)買到的對(duì)照品中地骨皮甲素的純度只有85%，因此本試驗(yàn)將地骨皮甲素和乙素作為一個(gè)指標(biāo)，以地骨皮乙素作對(duì)照品進(jìn)行成分含量的共同標(biāo)定，試驗(yàn)結(jié)果證明該方法是可行的。結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果，將地骨皮甲素、乙素作為地骨皮質(zhì)量控制的特征性指標(biāo)是合適的，且地骨皮中地骨皮甲素、乙素以地骨皮乙素計(jì)，含量不應(yīng)低于1 mg/g。

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