川貝清肺糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

薛非凡，曾 麗，王麗玉，李炳森

(1．湖北省襄陽市食品藥品監(jiān)督管理局，湖北 襄陽 441021;2．湖北省襄陽市第五人民醫(yī)院，湖北 襄陽441000;3．珠海正太制藥有限公司，廣東 珠海 519110)

川貝清肺糖漿由枇杷葉、苦杏仁、川貝母、麥冬、地黃、甘草、桔梗、薄荷組方，功能主治為清肺潤燥、止咳化痰，用于治療風(fēng)熱感冒引起的燥咳、咽干、咽痛。其收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第二冊(cè))》，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-0184-90，原標(biāo)準(zhǔn)無鑒別和含量測(cè)定。筆者增加了苦杏仁的理化鑒別，枇杷葉和甘草的薄層色譜鑒別及甘草酸的含量測(cè)定[1-10]，該方法可以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

LC-10A型高效液相色譜儀(日本島津)，包括SPD-10AVP紫外檢測(cè)器、CBM-102工作站;CP-225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);ZF紫外分析儀(上?？等A生化儀器制造廠);KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。枇杷葉對(duì)照藥材(批號(hào)為121261-200502)，甘草對(duì)照藥材(批號(hào)為 120904-200512)，甘草酸單銨鹽對(duì)照品(批號(hào)為110731-200614)，均購自中國藥品生物制品檢定所;硅膠G(青島海洋化工廠);甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、冰醋酸、醋酸銨、三硝基苯酚、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚(60～90℃)、乙醇、丙酮，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 理化鑒別(苦杏仁)

取本品適量，置試管中，試管中懸掛1條三硝基苯酚試紙[取三硝基苯酚適量，制成飽和水溶液，將濾紙條浸入其中，濕透后，取出，陰干，即得;臨用時(shí)，浸入碳酸鈉溶液(1→10)中，使均勻濕潤]。用軟木塞塞緊，置溫水浴中，20 min后試紙顯磚紅色。另取苦杏仁陰性樣品，同法操作，試紙不變色，陰性無干擾。

2．2 薄層色譜鑒別

枇杷葉:取本品30 mL，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨試液萃取2次，每次30 mL，棄去水層，正丁醇液加正丁醇飽和的水30 mL洗滌1次，棄去水層，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含枇杷葉的自制樣品30 mL，同供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。另取枇杷葉對(duì)照藥材2 g，加水100 mL，加熱，保持微沸30 min，濾過，濾液濃縮至約30 mL，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)[4]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(15∶7)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺枇杷葉的陰性樣品無干擾(見圖1 A)。

圖1 薄層色譜圖

甘草:取本品10 mL，加水10 mL，搖勻，加乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘?jiān)右掖贾? mL，作為供試品溶液。取不含甘草的自制樣品10 mL，同供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。另取甘草對(duì)照藥材0．5 g，加水30 mL，加熱，保持微沸30 min，濾過，取濾液同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)[4]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(12∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺甘草的陰性樣品無干擾(見圖1 B)。

2．3 甘草酸含量測(cè)定

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Discovery C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2);流速:1 mL/min;柱溫:27℃;檢測(cè)波長:250 nm。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2．3．2 溶液制備

精密吸取本品5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理15 min，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。精密稱取甘草酸單銨鹽對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含 40 μg 的溶液(折合甘草酸為 39．18 μg)，即得對(duì)照品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察

圖3 高效液相色譜圖

測(cè)定波長選擇:取甘草酸單銨鹽對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成適宜質(zhì)量濃度的供試品溶液，于紫外分光光度計(jì)上掃描測(cè)定。結(jié)果在348．2 nm和249．0 nm波長處有最大吸收，參照中國藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，選用250 nm作為測(cè)定波長。

干擾試驗(yàn):分別精密吸取樣品和不含甘草的陰性樣品溶液各10 mL，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液，分別吸取10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果在甘草酸峰相應(yīng)的位置上，僅有微小色譜峰出現(xiàn)，其峰面積僅為樣品峰面積1．67%，表明陰性樣品對(duì)本品含量測(cè)定無明顯影響(見圖2)。

線性關(guān)系考察:精密稱取甘草酸單銨鹽對(duì)照品0．011 2 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得224 μg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取此溶液 20，5，5，5 mL，分別置 25，10，25，50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得 179．2，112，44．8，22．4 μg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取以上對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，測(cè)定峰面積。以甘草酸單銨鹽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=641 433．1X-3 985．1，r=0．999 9(n=6)。結(jié)果表明，甘草酸單銨鹽進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0～224 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積分別為 242 296，243 916，244 139，245 168，250 999，250 961，平均 246 246．5，RSD=1．54%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，在 0，2，4，6，8，10 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積分別為 183 831，184 960，183 008，182 890，182 141，181 150，平均 182 996．7，RSD=0．72%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品6份，每份5 mL，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果樣品含量分別為 0．344，0．345，0．343，0．344，0．339，0．341 g/L，平均 0．342 g/L，RSD=0．58%(n=6)，表明方法的重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(含量為0．342 g/L)6份，分別添加甘草酸單銨鹽對(duì)照品溶液(0．252 g/L)適量，按擬訂方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 甘草酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

耐用性試驗(yàn):考察改變流動(dòng)相中有機(jī)相的量(±5%)、流動(dòng)相的 pH(±0．2)、柱溫(25 ℃，40 ℃)、流速(±0．2 mL/min)對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，改變流動(dòng)相中有機(jī)相的量、pH、柱溫、流速對(duì)結(jié)果幾乎無影響，說明方法耐用性較好。

2．3．4 樣品含量測(cè)定和含量限度確定

取10批樣品，分別照擬訂方法測(cè)定含量。結(jié)果見表2。10批含量測(cè)定結(jié)果表明，樣品中甘草酸的平均含量為0．305 g/L，按80%計(jì)，為0．244 g/L，故暫訂本品含量限度為每1 mL含甘草以甘草酸計(jì)，不得少于0．24 mg。

3 討論

苦杏仁所含的苦杏仁苷為氰苷，水解后產(chǎn)生氫氰酸，對(duì)呼吸中樞呈鎮(zhèn)靜作用，使呼吸運(yùn)動(dòng)趨于安靜而達(dá)到鎮(zhèn)咳的作用，為止咳的有效成分，故對(duì)其進(jìn)行鑒別[2]。由于苦杏仁苷不穩(wěn)定，以其水解產(chǎn)物氫氰酸與三硝基苯酚試紙的顯色反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行鑒別。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(g/L，n=10)

以文獻(xiàn)[1]甘草含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相甲醇-0．2 mol/L醋酸銨-冰醋酸(63∶37∶1)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果樣品中甘草酸色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰分離不好，且此流動(dòng)相含緩沖鹽，對(duì)色譜柱傷害較大，平衡時(shí)間較長;以文獻(xiàn)[2]選用的乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2)為流動(dòng)相，結(jié)果甘草酸色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰分離較好，理論板數(shù)較高，保留時(shí)間適宜，故選用此流動(dòng)相作為本品的流動(dòng)相。

精密吸取本品3份，每份10 mL，置50 mL容量瓶中，分別加50%甲醇、稀乙醇、流動(dòng)相各40 mL，超聲處理15 min，放冷，分別加50%甲醇、稀乙醇、流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻、濾過、進(jìn)樣，測(cè)定各份樣品的含量，以確定提取溶劑。結(jié)果表明，3種溶劑中流動(dòng)相提取含量最低(0．18 g/L)，稀乙醇和50%甲醇提取所得含量無明顯差別(0．20～0．22 g/L)。由于甲醇毒性大，從環(huán)保的角度考慮，故選擇稀乙醇作為提取溶劑。

精密吸取本品3份，每份10 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇40 mL，分別超聲處理10，15，25 min，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，測(cè)定各份樣品的含量，以確定提取時(shí)間。結(jié)果表明，超聲提取15 min即提取完全，故確定提取時(shí)間為15 min。

[1]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

[2]刑建國，黃 華，吳韜．高效液相色譜法測(cè)定小兒止咳糖漿中甘草酸的含量[J]．中藥新藥與臨床藥理，2002，4(13):255-256．

[3]陸文?。咝б合嗌V法測(cè)定復(fù)方川貝止咳糖漿中甘草酸含量[J]．中國藥業(yè)，2007，16(4):40-41．

[4]韋向紅．HPLC法測(cè)定復(fù)方桔梗止咳片中甘草酸的含量[J]．廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006(2):67-69．

[5]李亞芳，劉圣梅，張新學(xué)．HPLC法測(cè)定川貝止嗽合劑中甘草酸的含量[J]．齊魯藥事，2009(4):207-208．

[6]范 瑞，劉汝成，馮 慧．高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸的含量[J]．海峽藥學(xué)，2010(8):113-114．

[7]崔淑芬，張信青，許柏球，等．高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定甘草中甘草酸和甘草苷的含量[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006(3):307-308．

[8]馮會(huì)生，田桂芳．高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方鋁酸鉍顆粒中甘草酸含量[J]．中國藥業(yè)，2007，17(6):32-33．

[9]王春紅，郭強(qiáng)功，蘭天軍，等．高效液相色譜法測(cè)定六味丁香膠囊中甘草酸含量[J]．中國藥業(yè)，2009，18(22):34-35．

[10]闕瑞艷，周小軍，季 芳，等．高效液相色譜法測(cè)定胃痛寧片中甘草酸的含量[J]．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007(4):265-266．