保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及雙歧桿菌共生關(guān)系和對攪拌型酸乳特性的影響

王茜，陳明君，王寶維,，葛文華，張名愛,，岳斌，李凱玲

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島266109；2.濰坊紫鳶乳業(yè)發(fā)展有限公司，山東 濰坊261045；3.國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營養(yǎng)與飼料功能研究室，青島266109）

0 引 言

酸乳在乳制品中占據(jù)了重要的位置[1]，攪拌型酸乳作為其中的一種，口味多樣、營養(yǎng)豐富[2]，越來越受到大家的歡迎。保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌是酸乳生產(chǎn)中常用的發(fā)酵劑[3]，傳統(tǒng)酸乳主要使用二者混合發(fā)酵[4]。雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性桿菌，是最早發(fā)現(xiàn)的益生菌，維護(hù)著人類胃腸道的健康[5]，常洪美等[6]研究表明，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌三聯(lián)活菌具有清除腸道大腸埃希菌（產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶）的作用。研究保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌以及雙歧桿菌混合發(fā)酵的最佳工藝，生產(chǎn)出人體可以直接吸收與利用的酸乳飲品，可以為保健型酸乳的開發(fā)探索一條新的途徑，對人類健康具有重要意義。Sangita Bansal 等[7]以花生為原料，研制出一種益生菌酸乳，探究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對酸度、黏度等方面的影響。Chipurura B 等[8]使用猴面包樹果肉制備攪拌型酸乳，并對其進(jìn)行口感、質(zhì)地等進(jìn)行了感官評(píng)定。另外，酸乳的質(zhì)地受發(fā)酵劑菌種、熱處理溫度等方面的影響[9]，酸度、粘度是酸乳品質(zhì)重要的衡量標(biāo)準(zhǔn)。目前，對于使用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌以及雙歧桿菌三者混合發(fā)酵的共生特性和對酸乳品質(zhì)影響的研究較少，市場研發(fā)的類似產(chǎn)品還處于空白。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌以及雙歧桿菌3 個(gè)菌株的共生特性和對酸乳品質(zhì)的影響，篩選出攪拌型酸乳最佳發(fā)酵工藝，旨在探明新型攪拌型酸乳工藝，為保健型酸乳新產(chǎn)品開發(fā)拓寬出新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

保加利亞乳桿菌（LB）、嗜熱鏈球菌（ST）、雙歧桿菌（B），丹尼斯克公司；原料乳，濰坊紫鳶乳業(yè)發(fā)展有限公司。

DNP-9162A 電熱恒溫培養(yǎng)箱，海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，JZH6000-40 均質(zhì)機(jī)，上海錦竹機(jī)械設(shè)備有限公司，LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠，NDJ-1 旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)，青島心成發(fā)展商貿(mào)有限公司，HSY2-SP 恒溫水浴鍋，龍口市電爐制造廠提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵劑的制備

脫脂乳培養(yǎng)基制備∶將全脂奶粉充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ谭邸盟亓勘葹?∶8），分別裝入干燥的三角瓶和試管中，在滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min，冷卻至43 ℃?zhèn)溆谩?/p>

調(diào)制母發(fā)酵劑：將活化的菌種按全脂乳量2%～3%接種于裝有滅菌全脂乳的三角瓶，充分混勻后，置于恒溫箱中培養(yǎng)2.5 h，可供制備工作發(fā)酵劑。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 單一菌種最佳接種量

將1%、2%、4%的LB、ST、B 分別接種于優(yōu)質(zhì)鮮奶中，42 ℃恒溫箱中連續(xù)發(fā)酵8 h，記錄酸度、黏度、口感的變化。

1.2.2.2 混合發(fā)酵最佳接種比例

將菌種按照接種比例LB∶ST∶B=1∶1∶1、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2 進(jìn)行接種，在42 ℃恒溫箱中連續(xù)發(fā)酵8 h,記錄酸度、黏度、口感的變化。

1.2.2.3 最佳發(fā)酵溫度

按照比例LB∶ST∶B=1∶1∶2 接種，發(fā)酵溫度分別為40 ℃、42 ℃和44 ℃，發(fā)酵8 h 每隔2 h 測一次酸度，記錄酸度、黏度以及口感的變化。

1.2.2.4 最佳熱處理溫度

取100 g 鮮 奶，配 料 處 理 后，在85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃熱處理溫度下處理5 min 后分別進(jìn)行酸度和黏度測定及感官評(píng)定。

1.2.2.5 最佳均質(zhì)溫度

取100 g 鮮 奶，配 料 處 理 后，在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃溫度下（均質(zhì)壓力為22 MPa）進(jìn)行均質(zhì)，然后分別進(jìn)行酸度、黏度測定及感官評(píng)定。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度、熱處理溫度、均質(zhì)溫度三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)而篩選出最佳工藝組合。采用L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 酸度測定[10]

取10 mL 乳樣，滴加3 滴1%酚酞指示劑，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，直至出現(xiàn)粉紅色且30 s不退色。試驗(yàn)平行3 次。計(jì)算方法：酸度（°T）=氫氧化鈉濃度×滴定所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)×100。

1.2.5 黏度測定[11]

通過NDJ—1旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)進(jìn)行測定。

1.2.6 感官評(píng)定

采用7 人（3 男4 女）組成評(píng)價(jià)小組，首先明確感官評(píng)定的指標(biāo)以及注意事項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)避免吸煙、吃口香糖等行為，以減少感官評(píng)定的誤差。評(píng)定結(jié)束后，收集所有評(píng)定表，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[12]

1.2.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

在該研究中，每個(gè)試驗(yàn)平行3次（n=3），結(jié)果以x±s表示，使用軟件Origin8.6對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 接種量對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響

（1）保加利亞乳桿菌的接種量對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響。

由圖1 和圖2 可知，接種量對酸度、黏度有較大的影響。接種量為1%時(shí)，由于接種量少，菌體生長緩慢，酸度、黏度相對較低，質(zhì)地軟，有輕度的流動(dòng)，凝乳效果不佳，接種量為4%時(shí)，酸味強(qiáng)烈，乳清大量析出，接種量為2%時(shí)，感官評(píng)分最高。因此，保加利亞乳桿菌的最佳接種量為2%。

圖1 不同接種量的保加利亞乳桿菌對各理化指標(biāo)的影響

圖2 不同接種量保加利亞乳桿菌對感官評(píng)分的影響

（2）嗜熱鏈球菌的接種量對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響。

由圖3 和圖4 可知，接種量為1%時(shí)，由于接種量少，菌體生長緩慢，酸度、黏度較低，接種量為4%時(shí)，酸度、黏度偏大，4 h 后粘度無顯著變化。接種量為1%時(shí)，酸味不佳，接種量為4%時(shí)，酸度、黏度較高，酸味強(qiáng)烈，有較大黏稠性，乳清大量析出，接種量為2%時(shí)，感官評(píng)分最高，因此，嗜熱鏈球菌的最佳接種量為2%。

（3）雙歧桿菌的接種量對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響。

由圖5 和圖6 可知，雙歧桿菌在發(fā)酵后期，酸度、黏度開始增長。酸乳口感較差，酸味不理想，口感粗糙，接種量為2%時(shí)，感官評(píng)分最高。因此，雙歧桿菌的最佳接種量為2%。

圖3 不同接種量嗜熱鏈球菌對各理化指標(biāo)的影響

圖4 不同接種量的嗜熱鏈球菌對感官評(píng)分的影響

圖5 不同接種量的雙歧桿菌對各理化指標(biāo)的影響

圖6 不同接種量的雙歧桿菌對感官評(píng)分的影響

2.1.2 不同菌種比例對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響

由圖7 和圖8 可知，酸度隨著發(fā)酵時(shí)間的增長呈上升趨勢，菌種比例為1∶2∶1 時(shí)，酸度、黏度最大。菌種比例為1∶1∶1 與1∶1∶2 時(shí)，酸乳感官評(píng)分較高，考慮到產(chǎn)品口感與生產(chǎn)成本，最佳的菌種比例為1∶1∶1。

圖7 不同菌種比例對各理化指標(biāo)的影響

圖8 不同菌種比例對感官評(píng)分的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響

由圖9 和圖10 可知，酸度隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈上升趨勢，在2～4 h 時(shí)，酸度、黏度均快速增長，在4～10 h黏度無顯著性變化。44 ℃發(fā)酵時(shí)，由于發(fā)酵溫度較高，乳清大量析出，酸味濃郁，40 ℃發(fā)酵時(shí)，酸乳口感較差，42 ℃發(fā)酵時(shí)，酸乳組織細(xì)膩，狀態(tài)均勻，有濃郁的奶香味，感官最佳。因此，最佳的發(fā)酵溫度為42 ℃。

圖9 不同發(fā)酵溫度對各理化指標(biāo)的影響

圖10 不同發(fā)酵溫度對感官評(píng)分的影響

2.1.4 熱處理溫度對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響

由圖11 和圖12 可知，酸度隨熱處理溫度的提高而增加，在80～95 ℃，隨著溫度的不斷增加，黏度呈上升趨勢；在95～100 ℃，黏度呈下降趨勢。在95 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值。因此，最佳的熱處理溫度為95 ℃。

2.1.5 均質(zhì)溫度對攪拌型酸乳品質(zhì)的影響

由圖13 和圖14 可知，酸度隨著均質(zhì)溫度的改變，無顯著變化；在40～60 ℃，隨著溫度提高，黏度呈上升趨勢，在60～80 ℃，黏度呈下降趨勢，在60 ℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值。因此，最佳的均質(zhì)溫度為60 ℃。

圖11 不同熱處理溫度對各理化指標(biāo)的影響

圖12 不同熱處理溫度對感官評(píng)分的影響

圖13 不同均質(zhì)溫度對各理化指標(biāo)的影響

圖14 不同均質(zhì)溫度對感官評(píng)分的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度、熱處理溫度、均質(zhì)溫度3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)而篩選出最佳工藝組合。采用L9（34）正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平。

根據(jù)R 值的大小可以得出本試驗(yàn)因素存在的顯著性順序，由表3 可知，感官評(píng)分的極差值RC＞RA＞RB，說明均質(zhì)溫度對酸乳的感官品質(zhì)影響最大，發(fā)酵溫度次之，熱處理溫度影響最小，最佳組合為A2B2C3，即LB、ST、B 混合發(fā)酵生產(chǎn)攪拌型酸乳時(shí)的最佳發(fā)酵溫度為42 ℃，熱處理溫度為95 ℃，均質(zhì)溫度為60 ℃。

3 討 論

3.1 單一菌種發(fā)酵與混合菌種發(fā)酵對酸乳品質(zhì)的對比影響

本試驗(yàn)通過單一菌種發(fā)酵對酸度黏度變化的影響研究發(fā)現(xiàn)，ST 的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏能力要強(qiáng)于LB 和B，B 產(chǎn)酸能力比較低，混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)酸產(chǎn)黏能力、口感優(yōu)于單一菌種，3 種菌互助合作，促進(jìn)生長，具有協(xié)同關(guān)系。劉永吉等[13]使用嗜熱鏈球菌、乳酸菌和雙歧桿菌混合發(fā)酵，探究其對崗稔酸乳發(fā)酵品質(zhì)的影響，研究結(jié)果表明，雙歧桿菌不適合單獨(dú)作為發(fā)酵劑使用，而應(yīng)該結(jié)合嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌復(fù)配使用。李志成等[14]在對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的產(chǎn)黏產(chǎn)酸特性研究時(shí)得出，混合菌種的產(chǎn)酸產(chǎn)黏能力強(qiáng)于單一菌種。

3.2 發(fā)酵溫度對酸乳品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同的發(fā)酵溫度對于菌種活力的影響是不同的，發(fā)酵溫度越高，酸乳酸度越高，黏度呈上升趨勢，對口感也有較大影響。李思寧等[15]在研究發(fā)酵溫度對酸乳感官、風(fēng)味等方面的影響時(shí)得出，溫度波動(dòng)使酸乳中的酮類物質(zhì)增多，烴類物質(zhì)明顯減少，溫度小范圍波動(dòng)對酸乳的凝乳時(shí)間、質(zhì)構(gòu)、感官影響不大。Sangita Bansal 等[16]對于益生菌大豆酸乳的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究表明，發(fā)酵溫度對于酸乳的理化性質(zhì)有一定的影響，隨著培養(yǎng)溫度的變化，大豆酸乳酸度急劇增長。所以，發(fā)酵溫度是影響酸乳發(fā)酵的一個(gè)重要的因素。

3.3 均質(zhì)條件對酸乳品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，均質(zhì)溫度對發(fā)酵酸乳的品質(zhì)有很大影響。若均質(zhì)溫度過低，會(huì)導(dǎo)致酸乳的口感粗糙，脂肪上?。蝗暨^高，會(huì)導(dǎo)致能耗增大，也無法改善產(chǎn)品質(zhì)量[17]，所以要嚴(yán)格控制均質(zhì)壓力。Nguyen H T H 等[18]研究了均質(zhì)化對水牛酸乳的結(jié)構(gòu)特性的影響，結(jié)果表明，均質(zhì)化可以減少乳清分離，最大限度的減少奶粉、穩(wěn)定劑等的需要，改善了水牛酸乳的品質(zhì)。

4 結(jié) 論

（1）保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及雙歧桿菌混合發(fā)酵能夠改善酸乳的品質(zhì)，3 種菌株協(xié)同發(fā)酵效果較好。

（2）最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：菌種比例LB∶ST∶B=1∶1∶1，菌種接種量2%，發(fā)酵溫度42 ℃，熱處理溫度95 ℃，均質(zhì)溫度60 ℃。