乳酸菌干預(yù)對高脂血癥大鼠營養(yǎng)物質(zhì)代謝影響

黃玉軍，姚瑤，戴穎，陳大衛(wèi)，瓦云超，瞿恒賢，顧瑞霞

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225127）

0 引 言

隨著生活水平的不斷提高，我國的超重和肥胖人群日益增加。由超重和肥胖會(huì)造成血脂偏高，高血脂癥對人類健康的危害已經(jīng)不容忽視，高脂血癥是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的主要原因之一，臨床上通常用他汀類藥物進(jìn)行治療，但藥物副作用對人體傷害極大[1-4]。

目前，關(guān)于乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對動(dòng)物或人有很多有益作用，能作為膳食補(bǔ)充劑有效干預(yù)脂質(zhì)代謝性疾病[5]、平衡腸道菌群、通過自身代謝產(chǎn)生多種消化酶、有機(jī)酸、營養(yǎng)物質(zhì)等，直接或間接參與宿主營養(yǎng)物質(zhì)代謝、吸收過程[6-9]等。近年來，益生菌干預(yù)心血管疾病是目前預(yù)防和臨床研究熱點(diǎn)。大量的人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明了擬桿菌、柔嫩梭菌、乳酸菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌等微生物在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)腸道菌群調(diào)節(jié)宿主的脂質(zhì)代謝，具有降低血清中的血脂、膽固醇水平的功能。

本研究通過建立高脂血癥大鼠模型，并用單一及混合乳酸菌進(jìn)行干預(yù)，取其糞便、血清、胰腺及食糜進(jìn)行指標(biāo)檢測，觀察營養(yǎng)物質(zhì)消化率、機(jī)體營養(yǎng)狀況相關(guān)血清生化指標(biāo)及胰腸消化酶的變化，探討乳酸菌干預(yù)對大鼠營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的作用規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus grx10）和發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum f5）由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離篩選保藏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物為160 g SPF 級(jí)的Wistar 雄性大鼠，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。在本院清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行7 d 適應(yīng)性喂養(yǎng)。飼料：高脂飼料（78.8%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽）購于南京協(xié)同生物工程有限公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)滅菌鍋（日本TOMY 公司）、生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（美國塞默飛世爾科技有限公司）、電子天平（1/10000）（梅特勒-托利多儀器有限公司）、Bio-Tek ELX800 酶標(biāo)儀（美國寶特公司）、全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi公司）。

1.1.4 藥品與試劑

淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）、TP、ALB、GLU、BUN 試劑盒（四川邁克生物科技有限公司）、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 灌胃樣品的制備

將活化三代后的菌株用PBS 緩沖溶液清洗并重懸制成菌懸液，調(diào)整其活菌數(shù)到109CFU/mL。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理

按各組間平均體重?zé)o顯著差異重新分為5 組（n=15）對照組（NC）、高脂模型組（MC）、grx10 發(fā)酵液組（GF）、f5 發(fā)酵液組（FF）和混合發(fā)酵液組（HF）。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其余全部飼喂高脂飼料造高脂模型，飼養(yǎng)期間，每天計(jì)算進(jìn)食量，每周稱取體質(zhì)量。從第3 周開始按體重計(jì)算灌胃量進(jìn)行灌胃，GF 組灌胃2 mL/100g grx10 菌株發(fā)酵液，F(xiàn)F 組灌胃2 mL/100g f5菌株發(fā)酵液，HF 組灌胃2 mL/100g 混合菌株（grx10∶f5=1∶1）發(fā)酵液，MC 與NC 組灌胃2 mL/100g 生理鹽水，連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 測定指標(biāo)和方法

1.2.3.1 蛋白質(zhì)表觀消化率及其他營養(yǎng)物質(zhì)的消化率

最后一周進(jìn)行消化代謝實(shí)驗(yàn)。從每組各取5 只，計(jì)算每只大鼠每日進(jìn)食量，并進(jìn)行糞便采樣持續(xù)5天。采集的糞便先通過105 ℃烘干至恒重，然后碾碎過篩，測定糞樣中的鈣、粗脂肪、粗纖維以及粗蛋白質(zhì)含量并與飼料中的含量計(jì)算得出各項(xiàng)營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。

參考GB/T 6432-2018[10]，凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量，采用Kjeltec 8400 全自動(dòng)凱氏定氮儀測定；參考GB/T 6433-2006[11]，以索氏抽提法測定粗脂肪含量；采用GB/T 5009.10-2003[12]測定粗纖維的含量；采用GB/T 6436-2002[13]測定鈣的含量。

營養(yǎng)素消化率=（該營養(yǎng)素?cái)z入量-該營養(yǎng)素排泄量）/該營養(yǎng)素?cái)z入量

1.2.3.2 血清生化指標(biāo)

灌胃結(jié)束后將大鼠禁食12 h，眼球取血，離心取上部分血清，利用全自動(dòng)生化分析儀測定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)的含量。

1.2.3.3 消化酶活性指標(biāo)

收集大鼠十二指腸和空腸前段的食糜，取下胰腺，放入-20 ℃冰箱中保存待測。測定前，拿出解凍，取0.2～0.3 g 樣品混合9 倍體積（v/w）的冷卻生理鹽水制成勻漿液，4 ℃，4 000 r/min，20 min，取上清液測定胰腺和食糜中的淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶活性。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS 16.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均使用軟件（Origin 2017）進(jìn)行制圖，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±sd）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌干預(yù)對大鼠蛋白質(zhì)表觀消化率及其他營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

有研究表明，乳酸菌干預(yù)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起積極作用，其作用機(jī)制有兩種：一是分泌大量用于營養(yǎng)物質(zhì)消化的消化酶；二是通過改變主要的營養(yǎng)物質(zhì)吸收部位小腸的結(jié)構(gòu)，使機(jī)體更易于營養(yǎng)的吸收[14]。代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 大鼠蛋白質(zhì)表觀消化率及其他營養(yǎng)物質(zhì)消化率（n=5，x±sd）

分析上圖可知，與NC 組相比，MC 組的粗纖維、粗脂肪和鈣的消化率以及粗蛋白的表觀消化率沒有顯著性變化（P＞0.05），說明高脂飲食對這幾種營養(yǎng)物質(zhì)的消化的影響不大；與MC 組相比，各干預(yù)組粗纖維、粗脂肪和鈣的消化率均有顯著性上升（P＜0.05），但對于前兩者的消化組間差異并不明顯，干預(yù)組的組間差異僅存在于鈣的消化率上，HF 組與其他兩組干預(yù)組相比，能顯著提高大鼠的總鈣消化率（P＜0.05），提示混合菌株發(fā)酵液干預(yù)有利于機(jī)體對鈣元素的消化吸收；與MC 組相比，各干預(yù)組的粗蛋白表觀消化率均有增長趨勢，但變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中對粗蛋白表觀消化率最高的是HF 組；綜合而言，乳酸菌干預(yù)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化，這與Lorek 等[15]和李新紅等[16]的研究一致。

2.2 乳酸菌干預(yù)對大鼠血清生化指標(biāo)的影響

從血清生化指標(biāo)可大致了解機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝的情況[17]，本研究通過測定各受試組大鼠血清TP（總蛋白）、ALB（白蛋白）、GLB（球蛋白）及BUN（尿素氮）并計(jì)算白球比A/B，從與機(jī)體細(xì)胞合成與再生以及免疫功能相關(guān)的指標(biāo)[18-20]進(jìn)一步研究益生菌對高脂血癥大鼠營養(yǎng)物質(zhì)代謝及消化吸收的作用規(guī)律。結(jié)果如表1所示。

表1 大鼠血清生化指標(biāo)（n=5，x±sd）

由表1 可知，與NC 組相比，MC 組的TP、GLB 、A/B 以及BUN 均有顯著性變化（P＜0.05），提示飼喂高脂飼料對大鼠機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝和營養(yǎng)狀況確實(shí)有影響，這與孔杰的研究一致[21]；與MC 相比，GF 組和FF 組GLB 和A/B 有顯著性上升（P＜0.05），TP、BUN水平有顯著性下降（P＜0.05），ALB 水平有所上升，但不顯著（P＞0.05），提示乳酸菌干預(yù)可能有助于機(jī)體細(xì)胞再生和蛋白質(zhì)合成與沉積，提高機(jī)體免疫功能，HF組僅GLB 水平和BUN 水平顯著性變化，且對這兩項(xiàng)指標(biāo)的干預(yù)效果優(yōu)于單一菌株干預(yù)，其余指標(biāo)無顯著性變化（P＞0.05），但有改善的趨勢。

2.3 乳酸菌干預(yù)對大鼠消化酶活性的影響

消化酶主要是由胰腺分泌，且分泌量及分泌的酶活性受外界因素影響[22]。按照之前所述方法，測定各受試組大鼠胰腺內(nèi)淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性。結(jié)果如表2。

表2 大鼠胰腺消化酶活性（n=5，x±sd）

與NC 組相比，MC 組的胰腺消化酶活性無顯著性變化（P＞0.05），說明高脂飲食對大鼠胰腺消化酶活性的影響不大；與MC 相比，各干預(yù)組胰腺淀粉酶活性均顯著性下降（P＜0.05），說明乳酸菌干預(yù)后不利于胰腺中的淀粉酶發(fā)揮作用，各干預(yù)組的胰腺脂肪酶和胰蛋白酶活性的變化并不明顯（P＞0.05），益生菌干預(yù)后，胰脂肪酶活性有下降趨勢，胰蛋白酶活性有所上升，說明外源乳酸菌的攝入對這兩種消化酶活性的影響不大，但總體來說，乳酸菌攝入后降低了胰腺消化酶的活性，此結(jié)果與蔣正宇[22]的研究結(jié)果一致，添加外源性消化酶會(huì)降低內(nèi)源性消化酶的活性。

有研究表明，飼喂添加益生菌制劑的飼料后，有利于動(dòng)物的成長，營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝，增強(qiáng)免疫力等[23-24]。大鼠解剖后取腸道中的食糜，測定腸道消化酶活性，結(jié)果如表3。

表3 大鼠腸道消化酶活性（n=5，x±sd）

分析數(shù)據(jù)可知，與NC 相比，MC 組的腸道淀粉酶和脂肪酶活性顯著性下降（P＜0.05），胰蛋白酶活性的變化沒有顯著性（P＞0.05），說明高脂飲食對腸道淀粉酶和脂肪酶的影響較大；與MC 相比，F(xiàn)F 組與HF 組的腸道淀粉酶和脂肪酶活性顯著上升（P＜0.05），提示乳酸菌的種類在對腸道淀粉酶的影響中起關(guān)鍵作用，而不是菌株的數(shù)量，其中HF 組的效果優(yōu)于其余兩組，說明益生菌干預(yù)對機(jī)體消化吸收淀粉和脂肪有積極作用；與MC 組相比，各干預(yù)組腸道胰蛋白酶活性有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示不論是高脂飲食還是益生菌干預(yù)，對腸道胰蛋白活性的影響都不大，具體影響因素需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過先建立高脂血癥大鼠模型，然后用單一及混合乳酸菌進(jìn)行干預(yù)，對比各組數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)乳酸菌干預(yù)均有助于增強(qiáng)高脂血癥大鼠營養(yǎng)物質(zhì)代謝及消化吸收，提高血清生化指標(biāo)，加強(qiáng)蛋白質(zhì)合成與沉淀，改善胰腺及腸道消化酶活性，其中單一乳酸菌干預(yù)對于血清生化指標(biāo)的提高優(yōu)于混合乳酸菌，但對于腸道淀粉酶和脂肪酶活性的改善效果低于混合乳酸菌，其余指標(biāo)單一乳酸菌和混合乳酸菌的干預(yù)效果差異不大。