高脂飲食對大鼠免疫功能影響及熱滅活益生菌改善作用的初探

葛林，張瑜杰，蒲芳芳，王世杰，何方

（1.四川大學華西公共衛(wèi)生學院四川大學華西第四醫(yī)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學及毒理學系，成都 610041；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊050221）

0 引 言

隨著生活水平的日益提高，我國飲食習慣發(fā)生了明顯的改變：與過去相比，脂肪與糖類的攝入顯著增加。目前認為肥胖、動脈粥樣硬化和糖尿病等多種威脅人類健康的慢性疾病的發(fā)生都與高脂飲食存在一定關系[1]。有研究表明，高脂飲食導致的代謝異?？梢饳C體免疫系統(tǒng)功能的異常反應[2]。也有研究認為，高脂飲食將導致正常腸道菌群發(fā)生改變[3-4]。已有研究表明副干酪乳桿菌N1115 可以降低LDL-C 水平并改善血脂異常狀況[5]，也有研究認為N1115 對緩解非酒精性脂肪肝有作用[6]。但是以上研究均采用活菌N1115 進行研究，故本研究通過長期干預大鼠飲食，檢測大鼠生化指標和免疫指標的改變，以初步探究高脂飲食對機體免疫的影響，以及熱滅活副干酪乳桿菌N1115的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與受試乳酸菌

受試SPF 級雄性SD 大鼠購自四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所；熱滅活副干酪乳桿菌N1115由石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司提供。

24 只SPF 級雄性SD 大鼠體重約100～140 g，隨機分為對照組、高脂組和N1115 組（n=8/組）。飼養(yǎng)溫度23±1 ℃，濕度50%～60%，晝夜節(jié)律12 h，通風良好。適應性喂養(yǎng)7 d 后，空白組繼續(xù)飼喂普通飼料，高脂組和N1115組采用高脂飼料喂養(yǎng)。

受試乳酸菌為副干酪乳桿菌N1115（N1115菌）由石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司提供，N1115 菌是從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離出來的分類學上屬副干酪乳桿菌的國產(chǎn)益生菌。研究表明N1115 具有菌株特異性的耐酸耐膽堿鹽特性，可以活體形式進入人體腸道內(nèi)，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)及機體的免疫功能的作用。實驗前用生理鹽水溶解N1115 菌粉，進行65 ℃水浴2 h加熱處理，獲得熱滅活菌N1115菌液

采用灌胃法飼喂熱滅活副干酪乳桿菌N1115，按照大鼠體重的1%即1 mL/100 g 灌胃，N1115 濃度為1.4×109CFU / mL。

基礎飼料采用GB 配方，高脂飼料配方為：豬油15%、蔗糖20%、蛋黃粉5%、酪蛋白5%、鹽3%、膽固醇2%、基礎飼料50%。高脂飼料與基礎飼料均為粉末狀，具體成分見表1，三大營養(yǎng)素熱能比見表2。

干預期間每天觀察大鼠的一般情況，每天記錄各組大鼠的投食量和剩食量，每周計算各組大鼠日平均膳食及能量攝入量。每周測量空腹體重。第0、5、10和18周測量大鼠FBG、TG和TC。第18周時采集5 mL股動、靜脈血，靜置2 h，2000×g 離心15 min，-80 ℃凍存。脊椎脫臼處死大鼠，取肝、脾、肺、腎周和睪周脂肪稱重。

1.2 儀器和試劑

全自動生化分析儀AU400，奧林巴斯（中國）有限公司；通用突變檢測系統(tǒng)DCode，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。

基礎飼料，成都達碩生物科技有限公司；精制實用豬油，成都中和陸肖油脂廠；蛋黃粉和膽固醇，成都寶信科技有限公司；蔗糖和食鹽，市售；Rat Total Adi?ponectin/Acrp30 Quantikine ELISA Kit，R&D Systems中國公司；Rat C-reactive protein ELISA Kit，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Rat Adipokine Magnetic Bead Panel 96-Well Plate Assay，默克有限公司（香港）；Luminex?Sheath Fluid，默克有限公司。

表1 基礎飼料和高脂高鹽飼料配方（g/100 g）

表2 基礎飼料和高脂飼料中三大營養(yǎng)素供能比（100 g）

1.3 生化指標檢測

取500 μL 血清，采用全自動生化分析儀測定FBG、TG 和TG。

采用ELISA 法檢測血清脂聯(lián)素、血清胰島素、瘦素、白介素1β（Interleukin 1β IL-1β）、白介素6（Inter?leukin 6 IL-6）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis fac?tor-α TNF-α）的水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計分析

SPSS 22.0 進行相關數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。定量資料統(tǒng)一用均數(shù)±標準誤（X±SEM）表示。3 次及以上重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析。在資料正態(tài)分布的條件下，若資料方差齊，組間比較采用t 檢驗；若資料方差不齊，組間比較采用t’檢驗。在資料非正態(tài)分布條件下，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 攝食量及能量攝入

三組小鼠在第6、11 周攝食量及能量攝入都顯著下降，其余時間攝食量及能量攝入情況較穩(wěn)定。相較于對照組，高脂組和N1115 組日均攝食量明顯降低（23.62± 0.37 vs 21.05± 0.30，P＜0.05；23.62± 0.37 vs 21.28±0.33，P＜0.05），但高脂組和N1115 日均能量攝入 顯 著 增 高（80.56± 1.63 vs 92.16± 1.30，P＜0.05；80.56±1.63 vs 93.16±1.83，P＜0.05），見圖1。

圖1 小鼠攝食量及能量攝入情況

2.2 體重及臟器系數(shù)

0-18周內(nèi)三組大鼠的體重均隨時間持續(xù)增長，但組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。相較于對照組，高脂組和N1115 組的脂體比增高（P＜0.05），高脂組的肝體比有升高趨勢，脾體比和肺體比有降低趨勢，但組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。相較于對照組，N1115 組肝體比有升高趨勢，脾體比有降低趨勢，無統(tǒng)計學意義，肺體比降低（P＜0.05），見圖3。

圖2 小鼠體重變化情況

2.3 血糖及胰島素

圖3 小鼠臟器系數(shù)

三組小鼠的空腹血糖值隨時間的變化波動，第5周達到高峰，隨后逐漸降低。三組間的血糖差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。相較于對照組，高脂組的胰島素有降低趨勢，N1115 組的胰島素有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

2.4 血脂

三組TC 均隨時間變化逐漸下降，第0 周時三組間TC 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但第5 周，第10周和第18 周時，高脂組TC 降低程度均小于對照組(P＜0.05)；第5 周，第10 周時，N1115 組TC 降低程度均小于對照組(P＜0.05)，第18 周N1115 組TC 降低程度與對照組相比無統(tǒng)計學差異，見圖5（a）。TG 隨時間變化而波動，從第0 周到第10 周逐漸升高，第10 周后又呈下降趨勢。相較于對照組，高脂組整體TG 顯著升高（0.99±0.04 vs 0.81±0.04, P＜0.05），見圖5（b）。

2.5 脂聯(lián)素、瘦素和細胞因子

圖4 小鼠空腹血糖及胰島素變化情況

圖5 小鼠血脂變化情況

高脂組血清脂聯(lián)素、IL-1β、IL-6 和TNF-α均低于對照組（P＜0.05）。三組間血清瘦素差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；見圖6。N1115 組血清脂聯(lián)素和瘦素均高于對照組（P＜0.05），IL-1β 低于對照組（P＜0.05），IL-6 和TNF-α低于對照組，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 小鼠脂聯(lián)素，瘦素及細胞因子檢測結(jié)果

3 討 論

目前認為高脂血脂的發(fā)生大多與遺傳和飲食因素有關，其產(chǎn)生的原因主要有脂類攝入過度、脂代謝異常和脂肪消耗減少。長期高脂飲食能夠引發(fā)高脂血癥，從而對機體健康造成多方面的不利影響甚至引發(fā)多種慢性疾病。本研究中使用高脂飼料對SD 大鼠進行長期飲食干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的代謝和免疫都發(fā)生了異常改變。

本研究中盡管使用了高脂飲食，但三組大鼠的FBG、胰島素和體重差異均不具有統(tǒng)計學意義，只有TC 和TG 顯著升高。說明該實驗中長期高脂飲食僅導致大鼠出現(xiàn)了脂代謝異常，而沒有出現(xiàn)糖代謝異常和肥胖。有研究表明高脂飲食會導致大鼠出現(xiàn)食量減少的情況[7]，這可能是導致高脂飲食組并未出現(xiàn)明顯肥胖的原因。從結(jié)果中也可以看出高脂組的日均能量攝入量高于對照組，但日均攝食量卻低于對照組。雖然體重沒有明顯差異，但高脂組體脂比顯著高于對照組，該情況與部分研究使用高脂飲食誘導非酒精性脂肪肝模型的結(jié)果相似[8]。本次實驗采用的均為正常大鼠而非基因缺陷大鼠進行長期高脂飲食干預，故此結(jié)果也說明由于正常個體代謝擁有一定的反饋調(diào)節(jié)機制，故長期高脂飲對其產(chǎn)生的影響是進行性發(fā)展的。同時，高脂組脂聯(lián)素的顯著降低說明長期高脂飲食在不導致肥胖的情況下仍然能引起機體代謝紊亂，且脂代謝紊亂發(fā)生先于糖代謝紊亂。

有研究表明肥胖可能引起機體的慢性炎癥，導致免疫功能出現(xiàn)異常反應，而這些改變往往存在于肥胖程度較高的動物模型及人群研究中[9-11]。同時，也有研究表明飲食因素引發(fā)的肥胖會導致大鼠肺部的免疫系統(tǒng)功能降低[12]。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)高脂組血清中的細胞因子IL-6，IL-1β以及TNF-α均低于對照組，且高脂組脾體比相較于對照組有下降趨勢。這與之前的研究結(jié)果相似，說明長期高脂飲食會導致正常大鼠的免疫系統(tǒng)功能受到抑制。

N1115 是從內(nèi)蒙地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中提取分離的傳統(tǒng)食品由來的乳酸桿菌，在動物及人群實驗中，發(fā)現(xiàn)N1115 具有菌株特異性地調(diào)節(jié)機體的免疫及脂代謝的功能[5,13]。同時在細胞實驗中，N1115 可介導調(diào)節(jié)免疫，抑制脂肪細胞的分化、推測菌株特異性地調(diào)節(jié)機體免疫可能是N1115 影響機體脂代謝的重要機制之一[14]。但是以上均是對N1115 活菌菌體或者是發(fā)酵乳的研究，有關滅活的N1115 的研究幾乎沒有報道過。近來有不少研究已經(jīng)指出，加熱滅活的乳酸菌菌體也具有免疫調(diào)節(jié)功能[15]。本次研究熱滅活的N1115 組TC 和TG 在第0、5、10 周與高脂組升高的趨勢相同，第18 周出現(xiàn)明顯的下降趨勢，趨近于對照組，IL-1β，IL-6 和TNF-α低于對照組，說明熱滅活的N1115 具有調(diào)節(jié)脂代謝和免疫功能的作用，證明了滅活菌的功效和活菌幾乎相同，但是相關機制和相關成分還需要在今后的研究中繼續(xù)探索。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)長期高脂飲食將會引起機體代謝功能和免疫系統(tǒng)的異常。在導致肥胖之前就可以引發(fā)脂代謝異常，并抑制機體免疫系統(tǒng)活性。而熱滅活的副干酪乳桿菌N1115 可以改善高脂飲食誘導的脂代謝異常、和緩解高脂飲食引起的機體免疫功能的下降。