雌激素相關(guān)受體α、β在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

夏亞斌，胡 昊，金 巖，黃曉旭，許 力，胡凱峰

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 胃腸外科，安徽 蕪湖 241001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)死亡疾病中排名第4位[1]。近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)以及習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，且發(fā)病年齡呈下降趨勢[2-4]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，涉及體細(xì)胞基因突變、異?；蛉诤?、基因拷貝數(shù)變異和表觀遺傳變化[5-6]。目前國內(nèi)外針對腫瘤相關(guān)基因及因子分子的研究日益深入，旨在最終通過基因及因子分子的檢測、調(diào)控來預(yù)防、治療腫瘤[7]。雌激素相關(guān)受體(estrogen-related receptor，ERR)主要包括α、β、γ三種亞型，即ERRα、ERRβ和ERRγ[8]，有研究表明ERR在控制細(xì)胞能量平衡、新陳代謝、生長和發(fā)育方面存在不同作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。如高效ERRα反向激動(dòng)劑在三陰性乳腺癌治療中發(fā)揮著有效作用[10]。同時(shí)ERR在前列腺癌等多種癌癥中高表達(dá)，可以有效地對患者的病情進(jìn)行評估以及預(yù)測[11]，但尚缺乏大樣本病例研究證實(shí)其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其臨床意義，本研究通過檢測雌激素相關(guān)受體α、β(ERRα和ERRβ)在200例結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)在病情評估以及預(yù)后判斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年1月～2016年1月在弋磯山醫(yī)院胃腸外科經(jīng)手術(shù)、病理證實(shí)為結(jié)直腸癌的患者共200例，分別取癌組織及癌旁組織；30對配對癌和癌旁組織標(biāo)本提取組織總RNA。結(jié)直腸癌病例具備完整的臨床病理資料及隨訪數(shù)據(jù)。所有患者術(shù)前均未接受放、化療及相關(guān)的抗腫瘤治療。

1.2 免疫組織化學(xué)法 采用免疫組織化學(xué)法檢測患者癌及癌旁組織中ERRα和ERRβ的蛋白表達(dá)情況。用于免疫組織化學(xué)染色的ERRα多克隆抗體、ERRβ多克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自Santa Cruz公司。所有組織蠟塊按4μm厚度進(jìn)行切片。癌及癌旁組織免疫化學(xué)染色過程：脫蠟水化→抗原修復(fù)→去內(nèi)源性酶→抗原封閉→ERRα及ERRβ一抗孵育→二抗孵育→發(fā)色→蘇木精復(fù)染→脫水、封片、鏡檢→結(jié)果判定。針對染色的強(qiáng)度以及染色的范圍進(jìn)行打分，強(qiáng)度及范圍各分為0分、1分、2分、3分(強(qiáng)度無染色記0分，淡黃色顆粒記1分，黃色顆粒記2分，棕黃色顆粒記3分。染色細(xì)胞比例評分:陽性染色細(xì)胞數(shù)<25%記0分，25%～50%記1分，51%～75%記2分，≥76%記3分)。綜合兩個(gè)分?jǐn)?shù)之積進(jìn)行評分，0～3分認(rèn)定為低表達(dá)，4～9分認(rèn)定為高表達(dá)。由病理科高年資醫(yī)師按照盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)并打分。收集患者腫瘤組織中的染色評分結(jié)果以及患者的臨床數(shù)據(jù)，分析ERRα和ERRβ表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征(腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度)以及患者生存情況的關(guān)系。

1.3 RT-PCR 按Trizol試劑說明書提取各患者癌及癌旁組織總RNA，檢測其純度及濃度。選取Oligo dT為引物合成cDNA鏈，然后用RT-PCR方法檢測ERRα和ERRβ的mRNA表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，PCR反應(yīng)體系10 μL。反應(yīng)條件：分別95℃變性10 s，95℃變性5 s、60℃變性31 s，操作循環(huán)40次。內(nèi)參18 s，每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。ERRα和ERRβ引物序列見表1。

表1 引物序列

基因前引物后引物ERRαTGCGGTACAGTGTAACTGGGGAAACCGGGCTATCTGCTCGERRβCGAGAGCTACACGTTCACGGGGGTGTCGAGGGAAAAATAG18sCGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTC

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERRα和ERRβ mRNA水平在結(jié)直腸癌患者癌組織中呈高表達(dá) 本研究采用RT-PCR法分別檢測30對患者癌及癌旁組織mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERRα(癌旁組織平均值：6.613±0.3168；癌組織平均值：12.33±0.8014；t=6.63)和ERRβ(癌旁組織平均值：4.547±0.3115；癌組織平均值：9.77±0.4372；t=9.73)在癌組織的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.01,見圖1)，說明結(jié)直腸癌患者癌組織中ERRα和ERRβ存在高表達(dá)。

圖1 腸癌組織中ERRα和ERRβ均存在高表達(dá)

2.2 ERRα和ERRβ蛋白水平在結(jié)直腸癌患者癌組織中呈高表達(dá) 根據(jù)免疫組化結(jié)果對癌及癌旁組織中ERRα和ERRβ的表達(dá)高低情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中ERRα和ERRβ蛋白高表達(dá)率高于其在癌旁組織中的表達(dá)情況，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸癌及癌旁組織中ERRα、ERRβ蛋白高表達(dá)率比較[n(%)]

組別(n=200)ERRαERRβ癌組織120(60)112(56)癌旁組織58(29)62(31)χ238.9125.43P0.0000.000

表3 ERRα表達(dá)高低與結(jié)直腸癌臨床病理資料的關(guān)系

項(xiàng)目ERRα的表達(dá)低表達(dá)(n=80)高表達(dá)(n=120)χ2P年齡/歲 >604163 ≤6039570.0080.98性別 男性5184 女性29360.590.44腫瘤直徑 ≤5 cm73109 >5 cm7110.140.87組織分級 高分化22 中分化3122 低分化479610.350.005T分期 T1166 T21717 T31441 T4335616.40.001N分期 N03528 N11022 N21825 N3174511.520.01TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期5141 Ⅲ～Ⅳ期297915.74<0.001遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 否79116 是140.210.64

2.3 患者ERRα和ERRβ的表達(dá)與腫瘤臨床、病理特征的關(guān)系 本研究對200例結(jié)直腸癌患者組織的免疫組化結(jié)果結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ERRα和ERRβ蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征均有相關(guān)。兩者與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)。結(jié)果表明，腫瘤ERRα和ERRβ蛋白與腫瘤浸潤深度(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)、TNM分期及腫瘤分化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與年齡、性別等無相關(guān)性(見表3、4)。

表4 ERRβ表達(dá)高低與結(jié)直腸癌臨床病理資料的關(guān)系

項(xiàng)目ERRβ的表達(dá)低表達(dá)(n=88)高表達(dá)(n=112)χ2P年齡/歲 >603965 ≤6049470.730.32性別 男性5580 女性33321.430.23腫瘤直徑 ≤5 cm80102 >5 cm8100.110.91組織分級 好22 中3518 差51928.470.012T分期 T1168 T22014 T31738 T4355412.160.008N分期 N03330 N11320 N22122 N321414.560.047TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期5438 Ⅲ～Ⅳ期347414.89<0.001遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 否86109 是230.170.84

2.4 ERRα和ERRβ表達(dá)與患者生存的關(guān)系 結(jié)合患者預(yù)后資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生存時(shí)間<3年的患者，其ERRα和ERRβ高表達(dá)率高于生存時(shí)間≥3年的患者(P<0.05)(見表5)。

表5 不同生存年份組患者ERRα、ERRβ蛋白高表達(dá)率比較[n(%)]

組別(按生存時(shí)間)ERRαERRβ≥3年組(n=200)42(21)41(20.5)<3年組(n=200)78(39)71(35.5)χ26.685.54P0.0230.031

3 討論

ERR被發(fā)現(xiàn)是一類與雌激素受體密切相關(guān)的核受體，同時(shí)也是重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與人類細(xì)胞生物學(xué)層面行為的多個(gè)過程。研究表明ERR在代謝和癌癥等疾病的共同通路上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。越來越多的研究表明，ERR的異常表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。

ERRα和ERRβ是ERR中兩個(gè)最為重要的亞型。ERRα作為一種位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，被證明通過直接蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接觸與雌激素相互作用[13]。目前在腫瘤的研究中獲得廣泛的關(guān)注，如有研究發(fā)現(xiàn)ERRα促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞以及膀胱癌的發(fā)生發(fā)展[14-15]。ERRβ是一種與雌激素受體相似的蛋白質(zhì)，其異常表達(dá)在乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中具有著重要意義[16]。以往對ERR的研究較多集中在與內(nèi)分泌相關(guān)的腫瘤，但ERR在消化系統(tǒng)惡性腫瘤，特別在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中可能也發(fā)揮重要調(diào)控作用。

目前ERRα和ERRβ在結(jié)直腸癌中的研究國內(nèi)外文獻(xiàn)均有報(bào)道，如劉海宏等發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中ERRα和ERRβ蛋白表達(dá)高于癌旁組織，同時(shí)其陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度密切相關(guān)[17]。但此研究僅限于結(jié)腸癌，納入統(tǒng)計(jì)的ERRα和ERRβ免疫組化病例僅為44例與45例，在說服力上存在一定不足。Ding 等檢測了ERRα/β/γ在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有ERRα存在著顯著高表達(dá)，ERRα通過上調(diào)IL-8的表達(dá)，可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[18]。但此項(xiàng)研究只是在細(xì)胞生物學(xué)角度闡述了ERR在細(xì)胞中的作用，缺乏組織水平的驗(yàn)證及臨床資料的分析。

本研究收集有完整臨床相關(guān)資料的200例結(jié)直腸癌患者癌及癌旁組織，并通過30對患者的癌組織與癌旁組織ERRα和ERRβ mRNA表達(dá)的比較，發(fā)現(xiàn)ERRα和ERRβ在癌組織中表達(dá)明顯升高。免疫組化檢測結(jié)果也同樣表明ERRα和ERRβ的表達(dá)在癌組織明顯高于癌旁組織。我們結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ERRα和ERRβ的表達(dá)與結(jié)直腸癌組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TMN分期等有一定相關(guān)性。這說明ERR的表達(dá)與結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的惡性行為密切相關(guān)，腫瘤的惡性程度越高，分期越晚，侵襲行為越強(qiáng)，ERRα和ERRβ蛋白及mRNA的表達(dá)也越高。同時(shí)，本研究就ERRα和ERRβ的表達(dá)與患者的3年生存期進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)越高，3年的生存率越低，說明ERRα和ERRβ的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過檢測大樣本的結(jié)直腸癌患者癌及癌旁組織的表達(dá)，證實(shí)雌激素相關(guān)受體ERRα和ERRβ在結(jié)直腸癌患者癌組織中存在高表達(dá)，其表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合檢測ERRα和ERRβ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)有助于評估腫瘤的惡性程度、進(jìn)展程度以及患者的預(yù)后判斷，可能成為結(jié)直腸癌分子治療的潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)。