槐耳顆粒抑制肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究

吳 迪，吳雨瓊，喬軼才，孫一航，王 潞，吳志浩

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 a.臨床醫(yī)學(xué)院；b.影像學(xué)院；c.醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

肺癌是世界上最常診斷的癌癥(占總病例數(shù)11.6%)且居癌癥死亡首位(占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%)[1]。肺癌的常規(guī)治療包括手術(shù)、放療和化療。大多數(shù)患者對(duì)化療毒性和高昂的價(jià)格難以承受，需尋找成本相對(duì)低廉或無(wú)毒的藥物[2]?；倍?Huaier，HE)作為傳統(tǒng)中藥，其抗癌作用近年來(lái)引起了全世界的興趣[3]。臨床應(yīng)用已證實(shí)其抗癌效果,對(duì)肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤具有一定的療效。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，它是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，可以降低組織的黏附能力，驅(qū)使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的發(fā)生[4]。E-cadherin表達(dá)降低是EMT的發(fā)生標(biāo)志，Snail是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和最重要的E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子[5]。本研究對(duì)槐耳顆粒抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移作用進(jìn)行了探討,為以后的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299，受贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑及儀器 金克槐耳顆粒(啟東蓋天力藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Z20000109，規(guī)格：20 g×6袋/盒)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，小牛血清(GIBCO)，1.5 mol/L Tris-HCl(pH=8.8)、1 mol/L Tris-HCl(pH=6.8)、APS、TEMED(Beyotine)，NC膜(PALL)，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO、麗春紅(Sigma)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Eppendorf)，低溫水平搖床(New Brunswick)，電泳儀、小型垂直電泳槽(Bio Rad)，金屬浴D1100-230V(Labnet AccuBlock)，化學(xué)發(fā)光顯影成像系統(tǒng)(GE)，BioTek酶標(biāo)儀(伯騰公司)，流式細(xì)胞術(shù)試劑盒、流式細(xì)胞儀(BD)，抗體β-actin(Sigma)，抗體Snail、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、兔抗、鼠抗(CST)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞H1299和A549在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用10%小牛血清的培養(yǎng)基每1～2 d換液。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.25%的胰酶消化，用于目的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)槐耳處理前，行過(guò)夜饑餓。

1.2.2 槐耳溶液配制 電子天平稱(chēng)槐耳顆粒1g，溶于50 mL DMEM培養(yǎng)基中，配成20 mg/mL濃度藥液。37℃磁力攪拌器上攪拌2～3 h，充分溶解后，用0.22 μm濾過(guò)器過(guò)濾，4℃?zhèn)溆?，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于96孔板中，長(zhǎng)至80%～90%密度，加入0、2、4、6、8、10 mg/mL的槐耳處理24或48 h，各樣本設(shè)4組復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。加入新配制的0.5 mg/mL MTT溶液200 μL/孔，處理3～4 d后吸去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔，搖床避光震蕩10 min。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度。根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率(inhibitor rate，IR)(%)=(對(duì)照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100%計(jì)算每組抑制率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞流式術(shù) 細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，長(zhǎng)至80%～90%，饑餓過(guò)夜，給予槐耳(0、10 mg/mL)孵育24 h。收集舊的培養(yǎng)液，PBS洗3次，0.25%胰酶(不含EDTA)消化3 min，加培養(yǎng)基，吹打成懸液，2000 r/min×5 min離心，棄上清，預(yù)冷的PBS洗2次，離心后棄上清，調(diào)整每管細(xì)胞密度為(1～5)×105個(gè)。加入100 μL Binding Buffer/管后，加5μL FITC/管，混勻，再加入5 μL PI/管，混勻，最后再加400 μL Binding Buffer/管。室溫下避光反應(yīng)5～15 min。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。并用Flowjo7.6軟件分析。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔板中細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用滅菌的200 μL無(wú)核酸酶槍頭劃一條均勻的直線(xiàn)，PBS洗去漂浮細(xì)胞。分別加入0、5、10 mg/mL的槐耳，倒置顯微鏡100倍放大率下觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照(時(shí)間0 h)。將細(xì)胞進(jìn)一步與DMEM一起孵育24或48 h并再次拍照。計(jì)數(shù)遷移至0 h傷口區(qū)域的細(xì)胞數(shù)。劃痕傷口寬度=各時(shí)間段傷口面積/0 h傷口面積×100%。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 六孔板中細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，饑餓過(guò)夜。加入0、2、4、6、8、10 mg/mL的槐耳處理24 h后，蛋白收樣。取1×Laemmli sample buffer，放入100℃金屬浴中，煮2～5 min。取6孔板，1×PBS洗細(xì)胞，每孔加80 μL 1×Laemmli sample buffer，將收集的蛋白產(chǎn)物于100℃金屬浴中加熱8 min后，80V電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。麗春紅染色后，封閉1 h，4℃孵一抗過(guò)夜。次日，洗一抗3次，5 min/次，室溫孵二抗2 h，洗二抗3次，5 min/次，曝光，Image J分析灰度值。按上述方法提取蛋白樣品進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 乳酸實(shí)驗(yàn) 六孔板中細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，饑餓過(guò)夜。用0、2、4、6、8、10 mg/mL的槐耳處理24 h，加入終濃度為0、10、20 mmol/L的乳酸，處理3 h后收樣。

2 結(jié)果

2.1 槐耳顆粒能抑制肺腺癌細(xì)胞增殖 MTT結(jié)果顯示A549中，24 h IC50=7.6 mg/mL，48 h IC50=6.41 mg/mL；H1299中，24 h IC50=7.54mg/mL，48 h IC50=7.01mg/mL。A549的增s高，除2 mg/mL組外，48 h的抑制率均高于24 h。H1299中，24 h時(shí)除濃度8 mg/mL與6 mg/mL組比無(wú)意義外，其余抑制率隨濃度的升高而升高；當(dāng)濃度為6 mg/mL至更高時(shí)，48 h抑制率均高于24 h(見(jiàn)表1)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 A549和H1299中槐耳處理24 h和48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的影響(n=3)

HE/(mg/mL)A54924 h48 htPH129924 h48 htP00.00±0.000.00±0.00--0.00±0.000.00±0.00--225.86±2.07a27.30±1.07a1.0690.34520.37±1.54a15.97±1.92a3.0960.036434.31±1.16b41.81±2.15b5.3710.00628.50±0.81b25.15±2.69b2.0650.108638.67±1.25c48.61±0.29c13.4200.00038.33±0.62c46.82±1.28c10.3400.001848.24±1.16d58.00±1.58d8.6240.00141.30±1.7154.28±1.83d8.9760.0011062.84±2.79e73.40±1.45e5.8170.00454.33±1.91e66.09±1.56e8.2600.001F500.8001125.000642.800620.500P0.0000.0000.0000.000

注：2與0比較，aP<0.05；4與2比較，bP<0.05；6與4比較，cP<0.05；8與6比較，dP<0.05；10與8比較，eP<0.05。

2.2 槐耳可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，槐耳組早調(diào)、晚調(diào)及總凋亡細(xì)胞數(shù)增加(見(jiàn)圖1和表2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 槐耳對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移有抑制作用 劃痕結(jié)果顯示，遷移細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。與對(duì)照組相比，同時(shí)間段槐耳組的細(xì)胞遷移被顯著抑制，且10 mg/mL組比5 mg/mL組效果更明顯(見(jiàn)圖2、表3)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 槐耳能抑制腫瘤細(xì)胞EMT蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，槐耳組上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)增高，間充質(zhì)標(biāo)記蛋白N-cadherin、Vimentin及EMT核心蛋白Snail表達(dá)量均降低(見(jiàn)圖3和表4、5)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 A549和H1299細(xì)胞中槐耳組與對(duì)照組相比凋亡細(xì)胞數(shù)變化(n=3)

A549對(duì)照HE/(10 mg/mL)tPH1299對(duì)照HE/(10 mg/mL)tP早凋4.38±0.246.75±0.507.4010.0027.70±0.9516.70±0.6113.8100.000晚凋5.26±0.7933.00±1.2831.9400.0006.64±0.8341.80±1.6532.9700.000凋亡總數(shù)9.64±1.0339.75±1.7725.4700.00014.34±1.7758.50±2.2626.6400.000

表3 A549和H1299細(xì)胞中槐耳對(duì)遷移的影響(n=3) mg/mL

注：24 h與0 h比，aP<0.05，48 h與24 h比，bP<0.05；濃度(mg/mL)5與0組比，cP<0.05，10與5組比，dP<0.05。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)槐耳處理后對(duì)肺癌細(xì)胞A549和H1299凋亡的影響

圖2 在10×10倍倒置顯微鏡下劃痕結(jié)果

圖3 不同濃度槐耳處理細(xì)胞24 h的Western blot結(jié)果

表4 A549細(xì)胞中不同濃度槐耳處理后各蛋白表達(dá)量變化(n=3) mg/mL

表5 H1299細(xì)胞中不同濃度槐耳處理后各蛋白表達(dá)量變化(n=3) mg/mL

2.5 槐耳能抑制乳酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)源性Snail表達(dá)增多 Western blot結(jié)果表明，無(wú)槐耳作用時(shí)，除H1299中乳酸20 mmoL/L與10 mmoL/L比較無(wú)意義外，內(nèi)源性Snail表達(dá)均隨乳酸濃度升高而增加。而槐耳能有效抑制這種升高的內(nèi)源性Snail表達(dá)(見(jiàn)圖4和表5)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 Western blot結(jié)果顯示槐耳顆粒能夠抑制乳酸誘導(dǎo)的內(nèi)源性Snail蛋白表達(dá)

表6 H1299和A549細(xì)胞中乳酸條件下槐耳對(duì)Snail蛋白的影響(n=3)

乳酸/(mmol/L)H1299HE(0 mg/mL)HE(10 mg/mL)tPA549HE(0 mg/mL)HE(10 mg/mL)tP00.71±0.040.59±0.024.6480.0100.58±0.040.45±0.025.1060.007101.62±0.03a0.76±0.04a29.7900.0000.85±0.02a0.63±0.01a19.0700.000201.69±0.031.12±0.08b11.5600.0031.10±0.02b0.68±0.02b30.1900.000F791.20078.460320.000133.200P0.0000.0000.0000.000

注：10與0組比較，aP<0.05；20與10組比較，bP<0.05。

3 討論

肺癌是我國(guó)癌癥死亡的主要原因，且病死率隨著年齡的增長(zhǎng)而遞增[6]。它分為兩大類(lèi)：小細(xì)胞肺癌(SCLC，占所有肺癌的15%)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC，占所有肺癌的85%)。NSCLC可進(jìn)一步分為鱗狀細(xì)胞癌(SCC)，大細(xì)胞癌(LCC)和腺癌(AC)[7-8]。由于其具有侵襲性生物學(xué)特性且缺乏有效篩查方案,NSCLC患者在診斷時(shí)基本已達(dá)晚期。腫瘤的治療方法諸多,但治療效果差強(qiáng)人意,且副作用較大。因此，生物醫(yī)學(xué)科學(xué)迫切需要開(kāi)發(fā)副作用小、耐藥性低的新型抗癌劑以滿(mǎn)足癌癥患者的治療需求[9]?；倍且环N藥用真菌，作為中藥已應(yīng)用了約1600年。大量臨床應(yīng)用表明，槐耳具有良好的抗腫瘤作用,其有效成分主要為多糖蛋白(PS-T)[10]，然而其抗腫瘤的機(jī)制尚不明確。EMT與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有數(shù)據(jù)顯示超過(guò)90%的癌癥死亡與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生有密切聯(lián)系[11]。轉(zhuǎn)錄因子Snail作為C2H2型的一類(lèi)鋅指蛋白,主要通過(guò)SNAG結(jié)構(gòu)域和共抑制子C端結(jié)合蛋白組成轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的抑制,在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Snail蛋白水平與病理性腫瘤分期和組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，在侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，并且沉默該基因可能是腫瘤中潛在的治療靶點(diǎn)[12]。我們知道細(xì)胞增殖是癌癥發(fā)生、發(fā)展中不可或缺的過(guò)程，本研究中，我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了槐耳能有效抑制A549及H1299細(xì)胞的增殖，與之前研究相符。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也揭示槐耳能明顯誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡，我們可對(duì)此進(jìn)一步深入研究，探討其凋亡通路。同時(shí)，我們所進(jìn)行的體外劃痕測(cè)定實(shí)驗(yàn)，表明槐耳可能作為肺癌治療的有效抗轉(zhuǎn)移劑。接著，為探討其作用機(jī)制，我們運(yùn)用Western blot證明了槐耳可通過(guò)Snail抑制EMT發(fā)生過(guò)程進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的遷移，同時(shí)乳酸實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。雖然本實(shí)驗(yàn)證明了槐耳具有抗癌潛力，為槐耳顆粒在肺部腫瘤治療上提供一定的科學(xué)依據(jù)，開(kāi)辟了更有效的抗癌治療選擇，但仍存在一些局限性，我們目前無(wú)法得到關(guān)于槐耳在人體中的吸收、分布、代謝和排泄的信息，后期應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)臨床研究，使得其作為一種前瞻性抗癌候選藥物在治療惡性腫瘤方面發(fā)揮益處。