紅花注射液對肺癌A549細(xì)胞遷移的影響及分子機(jī)制研究

喬婷婷，鐘亮亮，朱宗鑫，胡耿維，潘 星，吳志浩，2

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤微環(huán)境研究室;2.醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

紅花注射液是一種從中藥紅花中提取而來，其主要成分為紅花醌苷、紅花素、花黃色素等的復(fù)合物，臨床上具有活血化瘀、改善微循環(huán)、增加組織血液灌流量等作用[1]。臨床上應(yīng)用較廣泛的是其從中藥紅花中提取制備的滅菌水溶液，其主要成分為紅花黃色素，具有一定的抗腫瘤作用[2]。但是，目前對于紅花注射液的抗腫瘤作用還知之甚少，其具體的抗腫瘤機(jī)制仍缺乏深入的探討。因此，本文通過研究紅花注射液的抗癌作用，發(fā)現(xiàn)其抑制肺腺癌A549細(xì)胞遷移，為今后的臨床治療和中藥聯(lián)合治療提供了理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 A549細(xì)胞(人源非小細(xì)胞肺腺癌上皮細(xì)胞系，ATCC)。

1.2 藥品與試劑 紅花注射液(華潤三九藥業(yè)有限公司，批號17120202003，國藥準(zhǔn)字Z51020673)；NF-κB抗體、Snail抗體、p-GSK-3β抗體、GSK-3β抗體購于CST公司；β-actin抗體、DMSO(sigma公司，美國)；polyjet(Signa Gen公司)；小牛血清(CIBCO公司，美國)；DMEM(HyClone公司，美國)；pRL-CMV質(zhì)粒(Promega公司，美國)；siRNA(吉瑪公司，中國)；GSK-3β抑制劑(Merck公司，美國)；流式凋亡試劑盒(BD公司，美國)；麗春紅染液、MTT、TEMED(碧云天公司，中國)；NC膜(PALL公司，美國)。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Eppendorf公司，德國)；BioTek酶標(biāo)儀(伯騰公司，美國)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)；4℃水平搖床(New Brunswick公司，美國)；化學(xué)發(fā)光顯影成像系統(tǒng)(GE公司，美國)；金屬浴D1100-230V(Labnet AccuBlock公司，美國)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇 將人肺腺癌A549細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，放在水浴鍋中輕輕搖晃，待融化后1500 r/min離心4 min，倒掉上清，加入含有10%小牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，混勻制成細(xì)胞懸液，放置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 MTT比色法檢測A549細(xì)胞的增殖抑制率 將A549細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度長至80%左右，分別按以下分組：陰性對照組(加相同劑量的DMSO終體積為100 μL/孔)、紅花注射液組(100、200、300、400、500 mL/L)處理培養(yǎng)12 h(藥物組用DMEM配好相應(yīng)的濃度分裝在不同的EP管里，隨后打入96孔板，每孔終體積為100 μL)。后加入5 μg/mL的MTT溶液，避光繼續(xù)放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后吸去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100μL/孔，搖床上避光搖15 min，用酶標(biāo)儀在波長為490 nm處測定其吸光度OD值。細(xì)胞增殖抑制率計算公式：增殖抑制率(%)=(對照組值-藥物組值)/對照組值×100%。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡 胰酶消化處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞長至80%時饑餓過夜，加入紅花注射液(100、200 mL/L)(根據(jù)WB結(jié)果選取最適濃度)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，離心收集細(xì)胞，使用1×Bingding Buffer吹打細(xì)胞重懸轉(zhuǎn)移至5 mL培養(yǎng)管中，同時加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 染液，輕輕渦旋細(xì)胞懸液并在室溫下(25℃)在黑暗中孵育15 min，最后向管中加入400 μL 1×Bingding Buffer，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.4.4 細(xì)胞劃痕實驗檢測A549細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞接種于六孔板，待密度長至90%時，用槍頭沿著細(xì)胞表面劃出一條筆直的線；輕輕搖動六孔板，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌5～6次，直至脫落的細(xì)胞完全洗去，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的劃痕情況；后饑餓細(xì)胞過夜并加100、200 mL/L紅花注射液處理。鏡下分別于紅花注射液處理的0、24、48 h觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照。用image J軟件量化分析。

1.4.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?細(xì)胞接種于十二孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到一定時，更換含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染Snail啟動子，5 h后換液，48 h后饑餓過夜，加入不同濃度紅花注射液處理。12 h后用外用1×PBS清洗兩次，配制1×PLB裂解液，每孔100 μL，然后將12孔板放在搖床上晃動20 min，4℃，14000 g，離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，上機(jī)檢測。

1.4.6 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染和siRNA轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞鋪于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，更換含有血清無抗生素的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染siRNA和cDNA，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，DMEM饑餓12 h加入不同濃度的紅花注射液。NF-κB siRNA的正義鏈序列為5′GCGACAGGUGCAGA-AAGAdTdT3，反義鏈序列為3′dTdTCGCUGUUCCACGUCUUUCU5。

1.4.7 Western blot 將A549細(xì)胞進(jìn)行鋪板，貼壁長滿后饑餓過夜。分別加入不同濃度(50、100、150、200、250 mL/L)的紅花注射液(根據(jù)MTT結(jié)果，紅花注射液在濃度為300 mL/L已達(dá)到半數(shù)致死量，故設(shè)置300 mL/L以下的濃度梯度)，12 h后收樣。使用Laemmli sample buffer裂解液收集細(xì)胞，進(jìn)行電泳跑膠轉(zhuǎn)膜封閉。所剪的蛋白條帶在4℃低溫?fù)u床中孵育相應(yīng)一抗過夜，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，后在AI600化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影。

2 結(jié)果

2.1 紅花注射液對A549細(xì)胞增殖抑制率的影響 不同濃度紅花注射液(100、200、300、400、500 mL/L)分別作用于A549細(xì)胞后，與對照組比較，各濃度的紅花注射液對A549細(xì)胞的增殖均有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.851，P<0.05，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。且紅花注射液抑制作用隨著濃度的提高也逐漸增強(qiáng)，即具有劑量依賴性(圖1)。

2.2 紅花注射液對A549細(xì)胞凋亡的影響 紅花注射液(100、200 mL/L)作用于A549細(xì)胞12 h后，與對照組相比，藥物組隨著紅花注射液濃度的增加凋亡細(xì)胞數(shù)增多(圖2)(F=12.30，P<0.05，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。

2.3 紅花注射液對A549細(xì)胞遷移的影響 100、200mL/L紅花注射液作用于A549細(xì)胞0、24、48 h后于顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞的遷移情況，以傷口愈合面積來判定細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，對照組隨著時間的增加傷口愈合面積增加，傷口逐漸變小，表示細(xì)胞的遷移能力增加，而藥物組隨著時間的增加傷口愈合面積較對照組減少，并且傷口愈合面積隨著濃度的增加而減少，表示紅花抑制A549細(xì)胞的遷移(圖3)(F=26.218，P<0.05，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。

注：與Safflower 0 mL/L相比，***P<0.001;與藥物組相比，*P<0.05。

圖1 不同濃度紅花注射液對A549細(xì)胞的濃度-抑制率曲線

注：與Safflower 0 mL/L相比，*P<0.05。

圖2 不同濃度紅花注射液對A549細(xì)胞凋亡的影響

注：與Safflower 0 mL/L相比，**P<0.01,###P<0.001。

圖3 不同濃度紅花注射液對A549細(xì)胞遷移的影響

2.4 紅花注射液下調(diào)Snail蛋白的表達(dá) 紅花注射液(0、50、100、150、200、250 mL/L)作用于肺癌A549細(xì)胞12 h后，Snail蛋白表達(dá)均降低，并且高濃度紅花注射液處理組較低濃度處理組表達(dá)更低，具有濃度依賴性(圖4)。

2.5 紅花注射液在轉(zhuǎn)錄水平抑制Snail的表達(dá) 不同濃度濃度紅花注射液處理A549細(xì)胞后，通過雙熒光素酶報告基因檢測，與對照組相比，隨著濃度的增加，Snail啟動子活性下降，不同濃度紅花注射液處理組間的比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=11.918，P<0.05，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義)(圖5A)。轉(zhuǎn)染NF-κB siRNA后，Snail啟動子活性下降更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B)(F=10.373，P<0.05，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。

圖4 不同濃度紅花注射液對A549細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)的影響

A：與Safflower 0 mL/L相比，*P<0.05,**P<0.01;B：與Safflower 0 mL/L相比，**P<0.01,##P<0.01。

圖5 NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Snail啟動子活性

2.6 紅花注射液通過GSK-3β-NF-κB下調(diào)Snail蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示不同濃度紅花注射液作用A549細(xì)胞后，NF-κB蛋白水平以濃度依賴性方式下降(圖6A)；轉(zhuǎn)染NF-κB siRNA后，結(jié)果顯示Snail隨著NF-κB的沉默而下降(圖6B)；應(yīng)用GSK-3β通路抑制劑預(yù)處理A549細(xì)胞1 h后，加入200 mL/L紅花注射液，與對照組相比，單獨加藥組GSK-3β失活形式p-GSK-3β和NF-κB、Snail表達(dá)均下降，與單獨加藥相比，抑制劑處理組中p-GSK-3β表達(dá)上升，NF-κB、Snail蛋白表達(dá)亦隨之上升(圖6C)；A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GSK-3β cDNA并加入不同濃度紅花注射液(50、100 mL/L)，NF-κB和Snail蛋白表達(dá)隨著GSK-3β過表達(dá)而下降(圖6D)。

3 討論

近年來肺癌的治療及預(yù)后有了重大的進(jìn)展，增進(jìn)了我們對腫瘤進(jìn)展機(jī)制的理解，并推動了早期檢測和多模式護(hù)理的發(fā)展，然而，肺癌的總體治愈率和存活率仍然很低，特別是在轉(zhuǎn)移性疾病中[3]。因此，需要繼續(xù)深入研究新藥的機(jī)制以將臨床益處擴(kuò)大到更廣泛的患者群體中。紅花，菊科植物紅花的干燥管狀花，是預(yù)防和治療心血管疾病最常用的傳統(tǒng)藥物之一[4]。通常通過煎煮和酒精沉淀的方法制備紅花注射劑[5]。據(jù)報道，紅花注射液具有多種藥理特性，是一種活化血液循環(huán)、消散血瘀的中藥，并且在以單一或復(fù)方制劑形式的臨床環(huán)境中被廣泛用作抗腫瘤治療藥物[6]。研究發(fā)現(xiàn)紅花注射液對肝癌、胃癌和肺癌等實體腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用，但其具體抗癌作用機(jī)制尚不明確。本文研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度紅花注射液處理后，A549細(xì)胞增殖率和遷移受到抑制，并且凋亡率增加。表明紅花注射液通過抑制A549細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)凋亡來發(fā)揮抗癌作用，但其具體的分子機(jī)制仍需探討。

上皮間質(zhì)-轉(zhuǎn)化(EMT)是一種高度保守的過程，其中極化的上皮細(xì)胞失去黏附和緊密連接，成為遷移間充質(zhì)細(xì)胞，是在胚胎發(fā)生，傷口愈合和癌癥發(fā)病的背景下的一種細(xì)胞程序[7]。已有文獻(xiàn)鑒定了幾種激活EMT的轉(zhuǎn)錄因子。然而這些EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子中的一些通常在侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)開始之前很長時間以及在非侵入性腫瘤中表達(dá)[8]。Snail作為EMT中E-鈣黏蛋白表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子，在胚胎發(fā)育和腫瘤進(jìn)展中起重要作用[9]。EMT中的關(guān)鍵分子事件是Snail介導(dǎo)的上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白的下調(diào)，其導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞黏附的破壞以及隨后獲得更多的遷移和侵襲性表型[10]。NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子促進(jìn)超過100個靶基因的表達(dá)，其中大多數(shù)參與宿主免疫應(yīng)答[11]。基因敲除和其他研究也確立了NF-κB在免疫系統(tǒng)個體發(fā)育中的作用，也證明了NF-κB在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用[12]。有研究表明，NF-κB也是促進(jìn)EMT的一個主要的轉(zhuǎn)錄因子[13]。本實驗通過WB法證明紅花注射液可能通過下調(diào)Snail和NF-κB蛋白的表達(dá)來發(fā)揮其抑癌作用。根據(jù)之前的研究報道以及對Snail啟動子上可能存在的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Snail啟動子上存在NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，于是猜想紅花注射液可能通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Snail的表達(dá)，因此，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測不同濃度紅花注射液對Snail啟動子活性的影響，結(jié)果顯示紅花注射液通過NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Snail的表達(dá)。而文獻(xiàn)報道NF-κB的活性又受到GSK-3β激活的調(diào)節(jié)[14-15]。因此本實驗通過抑制劑進(jìn)一步確認(rèn)GSK-3β通路參與調(diào)控Snail和NF-κB的蛋白表達(dá)。

圖6 紅花注射液通過GSK-3β-NF-κB通路下調(diào)Snail表達(dá)

總之，實驗結(jié)果表明紅花注射液能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖遷移并誘導(dǎo)凋亡，其相關(guān)的機(jī)制可能與GSK-3β-NF-κB-Snail通路有關(guān)。實驗的下一步旨在探索：①NF-κB在Snail啟動子上發(fā)揮作用的具體結(jié)合位點以及定點突變輔以驗證。②GSK-3β是如何調(diào)控NF-κB的表達(dá)，是否促進(jìn)NF-κB的核移位進(jìn)而上調(diào)Snail啟動子活性還是通過其他途徑發(fā)揮作用？此外，本研究結(jié)果還需進(jìn)一步的體內(nèi)實驗以及對正常細(xì)胞是否具有一定的毒性加以驗證，為紅花注射液的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。