基因療法的挑戰(zhàn)：速度、樣本及法規(guī)

從左到右依次為Michael Meagher博士、Mani Krishnan和Claire Davies博士

多年來，開發(fā)單克隆抗體(mAb)藥物的路徑已經(jīng)得到了明確的定義和完善。但基因療法面臨的情況就不一樣了。雖然基因療法早在幾十年前就開始出現(xiàn)了，但直到最近幾年才有了進展，但是，這一領域依舊有很多未知和挑戰(zhàn)。由于缺乏合規(guī)的流程、一致的分析和明確的監(jiān)管指南，基因療法開發(fā)者必須創(chuàng)建自己的商業(yè)化路徑。這篇文章中三位業(yè)內(nèi)科學家，就基因療法的挑戰(zhàn)以及如何克服這些挑戰(zhàn)進行了探討。

Michael M.Meagher博士是圣猶德兒童研究醫(yī)院的副總裁，負責藥物生產(chǎn)和質(zhì)量；Mani Krishnan是SCIEX CE &生物制藥業(yè)務部門的副總裁兼總經(jīng)理；Claire Davies博士是賽諾菲生物分析副總裁。

挑戰(zhàn)一：基因療法不是傳統(tǒng)的生物學

蛋白質(zhì)藥物是使用成熟的細胞系制造的。Meagher博士說，一批蛋白質(zhì)或單抗是相當均勻的，可以通過分析整個批次以確認其特性和質(zhì)量。但用于基因療法和轉(zhuǎn)基因細胞療法的病毒載體卻不是這樣。兩到四個質(zhì)粒必須轉(zhuǎn)染每個細胞，并產(chǎn)生一個結(jié)構適合封裝轉(zhuǎn)基因并能產(chǎn)生病毒載體的衣殼蛋白。沒有穩(wěn)定的細胞系可以產(chǎn)生同樣的病毒載體。每一個細胞都必須被一系列質(zhì)粒復合物轉(zhuǎn)染才能產(chǎn)生病毒載體?？梢韵胂笫〉母怕屎驼T導異質(zhì)性的程度有多高。

Davies博士認為，改善基因療法生產(chǎn)的關鍵是開發(fā)一致的、可擴展的平臺，以提高生產(chǎn)產(chǎn)量?！暗彤a(chǎn)量問題可以通過改善轉(zhuǎn)染技術和載體設計來解決，以提高細胞系和病毒包裝的穩(wěn)定性。與此同時，更高細胞密度工藝的發(fā)展、改進的下游純化工藝以及更好的關鍵原料控制將提高生產(chǎn)的質(zhì)量和產(chǎn)量?！?/p>

目前實現(xiàn)穩(wěn)健工業(yè)生產(chǎn)的另一個障礙是缺乏快速的分析方法。Krishnan博士認為：“如果沒有快速的檢測，完全了解所有相關工藝參數(shù)，及其對產(chǎn)品質(zhì)量屬性影響的能力就很有限。這阻礙了穩(wěn)健工藝的發(fā)展。當病毒載體被用來修飾細胞時，困難就增加了?！?/p>

這就是CAR-T細胞療法面臨的情況。無論基因運載工具是腺病毒(AAV)或慢病毒(LV)，還是攜帶信使RNA、引導RNA或蛋白質(zhì)組成的基因編輯元件，其過程和產(chǎn)生的產(chǎn)物都是高度復雜的，只能在一定程度上表征。因為它們是如此復雜，觀察經(jīng)過基因改造的細胞隨時間的變化是非常必要的。轉(zhuǎn)基因造血干細胞(HSCs)的情況更加復雜，因為這些細胞是“永久的細胞”，會留在患者體內(nèi)。

“如果我們治療的是一個兩個月大的嬰兒，在這個孩子活到70歲之前，我們不會真正知道治療效果如何?！盡eagher博士說，“研發(fā)工作必須解決這一問題，我們不僅需要評估患者的長期存活率，還需要評估這些療法的長期影響。”

挑戰(zhàn)二：對速度的需求

基因療法的前景是巨大的。有超過7000種遺傳疾病可以用基因療法治愈。然而，盡管期望、興趣和投資都很高，但制造和分析基因治療產(chǎn)品的技術仍在進化中。許多用于制造基因治療產(chǎn)品的過程借用了基于貼壁細胞的傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)過程，導致滴度非常低。同樣，許多用于基因治療的分析方法也都是傳統(tǒng)的病毒分析方法。Krishnan說：“雖然這些檢測方法經(jīng)過了試驗和測試，但獲得結(jié)果需要大量時間?！崩?，目前的效能、功效和其他特性的檢測都是以細胞為基礎的，可能需要長達三周的時間。

“同樣，下游純化后的感染研究(TCID50)對于確認衣殼蛋白結(jié)構也很重要，但它們可能需要長達一周的時間。為了開發(fā)一個堅實的制藥生產(chǎn)工藝，實時檢測很重要。為了開發(fā)真正優(yōu)化的流程，并對是否推進一批生產(chǎn)做出有效決策，需要快速得到結(jié)果?！?/p>

缺乏優(yōu)化的流程和及時的檢測是造成基因療法成本高的巨大因素。使問題更加復雜的是，目前許多分析方法所得的結(jié)果是可變的。有些方法的正/負差異為50%。擁有堅實的、接近實時的、易于使用的、可重復的檢測方法對基因療法的進一步發(fā)展至關重要。Krishnan博士繼續(xù)說道?！霸诤侠淼臅r間內(nèi)提供強有力的快速檢測反饋，將使能對患者產(chǎn)生長期可持續(xù)影響的基因療法的發(fā)展成為可能，并完全改變游戲規(guī)則?！?/p>

Meagher博士表示，AAV和慢病毒載體用于基因療法、CAR-T細胞和HSC(CD34+)治療，基于細胞的效價測定面臨挑戰(zhàn)。他解釋道：“就預測效價模型的可用性而言，確定藥效的技術目前是有限的，我們也非常希望有生物物理表征方法來指示功能，因為它們在加速開發(fā)流程方面是非常寶貴的，特別是對于慢病毒載體?！?/p>

其他重要的分析包括衣殼翻譯后修飾的特性，生產(chǎn)過程中使用質(zhì)粒衍生的非產(chǎn)物DNA的定量，以及空與滿的衣殼比的測定?！凹皶r進行有效的分析對開發(fā)時間線有巨大的影響”，Meagher博士指出。

Davies博士表示，自動化和數(shù)據(jù)分析的進步有可能減少分析耗時。完全集成的系統(tǒng)可以在多孔板中制備樣品，自動將樣品放入儀器中進行分析，然后無縫地將采集到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到分析軟件中，這將簡化分析，同時提高一致性和準確性。最后，她希望能夠?qū)⒍鄠€設備完全集成到一個自動化的工作流程中，并能夠根據(jù)儀器傳感器的反饋有條件地調(diào)整儀器設置。她補充道：“如果我們能夠?qū)⑿碌姆蛛x系統(tǒng)與多閥配置結(jié)合起來，在分離的模式之間進行切換，并在數(shù)據(jù)導出為通用數(shù)據(jù)格式后，將其與自動數(shù)據(jù)處理和趨勢結(jié)合起來，將有助于開發(fā)完全自動化的工作流程?！?/p>

挑戰(zhàn)三：樣本量困境

病毒載體生產(chǎn)過程中的滴度低導致了對檢測所需樣品量的挑戰(zhàn)。在一項研究中，賽諾菲發(fā)現(xiàn)，用于早期臨床試驗的標準批次單抗生產(chǎn)了2003瓶，其中664瓶被用于測試，剩下的1339瓶用于臨床研究?；蛑委煹纳a(chǎn)批量要小得多，然而，如果是全身性的治療，那么需要檢測的數(shù)量將會更高。在Davies博士引用的一個例子中，制造的220瓶中，185瓶被用于測試，只剩下35瓶用于臨床研究。她指出，“即使是罕見疾病，也很難確保有足夠的材料用于臨床試驗。”

低產(chǎn)量和蛋白濃度僅在0.01 mg/mL數(shù)量級是一個復雜的挑戰(zhàn)，因為還存在分析方法不成熟和對產(chǎn)品了解有限的因素。“低產(chǎn)量就需要有戰(zhàn)略性的方法來減少檢測量”，Davies博士說，“由于蛋白質(zhì)濃度低和一般的安全要求，基因療法的分析需要更加靈敏?！迸e個例子，根據(jù)FDA的指導，考慮到患者使用的平均劑量和滴度，在篩選復制能力變異的慢病毒載體時，目前需要大量（每批10-100升）來顯示在每個患者劑量內(nèi)有<1個具有復制能力的慢病毒（RCL）。類似的問題也存在于具有復制能力的AAV中，因此顯然需要顯著提高用于此的基于細胞的分析的靈敏度。

她還指出，也有機會開發(fā)精益和戰(zhàn)略性的測試/控制范式，使用平臺技術和產(chǎn)品知識來減少檢測量需求的穩(wěn)定性測試設計。新型無損檢測方法的發(fā)展作為藥典方法的替代品，也將減少對檢測量的要求。然而，她補充說，任何減少樣本量的解決方案都必須便于質(zhì)量控制。

“我們在賽諾菲正在開發(fā)一種多屬性方法，使我們能夠從一個分析中獲得多個重要的結(jié)果，從而減少測試所需的產(chǎn)本總量。”Davies博士解釋道。比如用于多種衣殼特異性和DNA特異性屬性的方法。賽諾菲和圣猶大兒童研究醫(yī)院都開發(fā)了基于毛細管電泳（CE）的高靈敏度和高分辨率方法來測定AAV衣殼蛋白純度，該方法顯著減少需要的樣本量，且對質(zhì)控友好。

挑戰(zhàn)四：不斷發(fā)展的監(jiān)管指導和持續(xù)的溝通

雖然目前對于使用重組蛋白生物制劑的基因療法還沒有建立規(guī)范指南，但是監(jiān)管當局已經(jīng)表示支持正在發(fā)展的基因治療。FDA持續(xù)制定指導文件，以支持開發(fā)和商業(yè)化這些創(chuàng)新的、改變生活的藥物。最近，F(xiàn)DA公布了關于試驗藥物中內(nèi)毒素的指南。Meagher博士認為，無論基因治療產(chǎn)品是基于病毒載體，還是結(jié)合了CRISPR-Cas9等基因編輯技術，防止脫靶效應都是重點。“FDA鼓勵能快速有效地識別和量化脫靶的技術。”

他還補充說，這個領域正在以異乎尋常的速度發(fā)展：“競爭如此激烈，這太棒了，最好的技術將會勝出，這只會使病人受益，F(xiàn)DA正在與基因療法研發(fā)人員一起學習，并努力創(chuàng)造機會讓研發(fā)人員可以與FDA專家討論，來尋求最佳方法獲得最安全產(chǎn)品。他們希望幫助企業(yè)找到前進的最佳途徑。”

展望未來

Krishnan博士認為：“為了充分發(fā)揮基因療法在世界范圍內(nèi)對患者的潛力，SCIEX等供應商將繼續(xù)與研發(fā)人員合作，不斷創(chuàng)新并推動技術向前發(fā)展，以提供從概念到臨床的基因療法所需的快速、精確、可靠和高效的分析。希望不久以后，這些流程和分析變得足夠合格和完善，并能結(jié)合明確的監(jiān)管指導，確保生物制藥研發(fā)人員有一條良好的道路來開發(fā)和商業(yè)化基因療法，為需要疾病修飾治療或治愈的眾多患者服務。”

Meagher博士從研發(fā)視角提供了一個觀點：“我們最感興趣的是治療的安全性和加速臨床研究。隨著快速可靠的分析技術的發(fā)展，市場將得到改善，特別是那些能夠連接基于細胞的效價/療效分析的方法。從長遠來看，基于細胞的效價分析將是基因療法釋放檢測的一部分。當我們擁有與細胞分析相關的快速分析方法時，產(chǎn)品開發(fā)的時間和成本將會減少，而這一直是我們的目標。最偉大的任務是讓全世界的每個病人都能負擔得起這些療法！”

Davies博士闡明：“在生產(chǎn)和分析方面，基因和細胞治療開發(fā)中的創(chuàng)新、戰(zhàn)略性和數(shù)字化方法將促進我們對過程和產(chǎn)品的理解，為患者提供負擔得起的個性化治療。不僅基因療法方法會不斷改進和提速，而且正交工具的開發(fā)將有助于提高我們對產(chǎn)品質(zhì)量屬性及其對患者安全和療效的潛在影響的理解?！薄觯ㄕ悦馈渡羁萍肌罚?/p>