攜帶稻瘟病菌的大麥粒作為載體在殺菌劑篩選中的應(yīng)用

鄧 云 ，蘇 妍 ，應(yīng)薛養(yǎng) ，許 卿 ，連 珊 ，方 旭 ，吳娟娟

（1．福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建南平354200；

2．建陽市農(nóng)業(yè)局，福建南平354200；3．南平市種子管理站，福建南平354200）

稻瘟病菌屬于稻梨孢菌屬。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一，每年由其造成的水稻損失可占水稻總產(chǎn)量的10%～30%，是阻礙水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一［1-2］。至今為止，稻瘟病遍及世界各大水稻主產(chǎn)區(qū)，其中以亞洲和非洲病情較為嚴(yán)重。福建省稻瘟病常年發(fā)生，嚴(yán)重危害水稻產(chǎn)量，一般情況下稻瘟病只在局部地區(qū)發(fā)生，如果品種感病，又逢有利于發(fā)病的氣候條件，稻瘟病則會(huì)大面積發(fā)生、流行，對水稻生產(chǎn)造成極大威脅［3］。

目前，對稻瘟病的防治主要是化學(xué)藥劑防治［4］。市場上防治稻瘟病的各類型各品牌殺菌劑種類繁多，由于耐藥性和殺菌劑質(zhì)量的影響使得這些殺菌劑對稻瘟病的防治效果參差不齊［5］。所以，在對稻瘟病進(jìn)行防治之前需要篩選效果好的殺菌劑，而篩選殺菌劑是一件費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。殺菌劑篩選分為實(shí)驗(yàn)室篩選和田間篩選兩種，田間篩選主要是通過設(shè)置三重復(fù)小區(qū)，測試殺菌劑對稻瘟病田間發(fā)病的控制作用，相對實(shí)驗(yàn)室篩選耗費(fèi)人力、物力、財(cái)力較多，不適合大批量篩選殺菌劑，因此，常采用實(shí)驗(yàn)室篩選方法來對稻瘟病藥劑進(jìn)行大批量初篩選［6-7］。現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室篩選方法主要是采用菌絲生長速率法，具體為：先制備長滿稻瘟病菌的大片菌餅；同時(shí)配置含有殺菌劑的平板培養(yǎng)基；然后，用菌種打孔器在大片菌餅上打取小顆粒菌餅，并將小顆粒菌餅長有菌絲的一面朝下放入含有殺菌劑的平板培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)；最后通過測量平板培養(yǎng)基上以小顆粒菌餅為中心的菌落的直徑大小來判斷殺菌劑的殺菌效果（菌落直徑越小，殺菌劑的殺菌效果越好）。但是，由于小顆粒菌餅的制作過程相對復(fù)雜，存在消毒不方便、操作過程繁瑣等問題，效率低，不利于大批量快速篩選殺菌劑；并且，小顆粒菌餅僅一面長有菌絲，其接種于平板培養(yǎng)基后小顆粒菌餅四周的菌絲長勢不均勻，影響菌落直徑測量的準(zhǔn)確性。因此，亟待尋找一種利于大批量快速篩選稻瘟病殺菌劑的方法。本技術(shù)方法提供一種快速篩選藥劑的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大麥粒（用于培養(yǎng)稻瘟病菌絲）。

制作一個(gè)白底黑字的塑料圓形十字刻度板，直徑為9 cm（如圖1所示）放在平板培養(yǎng)基的正下方。

培養(yǎng)基為可溶性淀粉培養(yǎng)基，其成分為：可溶性淀粉10.0 g，酵母膏2.0 g，CaCO33.0 g，瓊脂粉16.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 6.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大麥粒培養(yǎng)稻瘟病菌 35 g（約1 000粒）大麥泡水0.5 h后煮沸至半熟，承裝在250 mL的培養(yǎng)瓶中，高壓滅菌。將稻瘟病菌接菌到高壓滅菌過的大麥粒中，接菌后將培養(yǎng)瓶平放至培養(yǎng)箱內(nèi)25～28℃培養(yǎng)7～10 d，期間搖動(dòng)1次培養(yǎng)瓶，讓已長出的稻瘟病菌絲均勻分布整個(gè)培養(yǎng)瓶，以便充分均勻生長。培養(yǎng)大麥粒所用的培養(yǎng)瓶為250 mL的茄形培養(yǎng)瓶，側(cè)面為平面可以平放，有利于菌絲的橫向生長。

1.2.2 含藥劑平板培養(yǎng)基的制備 稱取一定量的各殺菌劑有效成分，無菌水溶解，稀釋成5個(gè)系列濃度藥液，濃度分別為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625μg/mL的藥液。準(zhǔn)確吸取藥液依次加入到融化的可溶性淀粉培養(yǎng)基中（直徑為9 cm的培養(yǎng)皿），充分搖勻，制備成含有所設(shè)計(jì)的藥劑濃度梯度的平板培養(yǎng)基。同時(shí)設(shè)置不含藥的平板作空白對照，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 十字交叉放置大麥粒 將攜帶稻瘟病菌的大麥粒放在離十字刻度板（圖1）的中心交叉圓點(diǎn)2～2.5 cm處，十字形對稱放置，每個(gè)培養(yǎng)皿放4粒大麥粒。大麥粒放置時(shí)為防止后續(xù)因移動(dòng)培養(yǎng)皿而造成大麥粒移動(dòng)，應(yīng)先在培養(yǎng)皿相對應(yīng)的位置用滅菌燒過的鑷子頭在瓊脂中點(diǎn)出小洞，后將長有菌絲的大麥粒鑲嵌于其中，防止位移，封口膜封口培養(yǎng)皿邊緣防止污染。

1.2.4 接菌后將平板培養(yǎng)基置放入25～28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7～10 d后調(diào)查結(jié)果，菌絲抑制效果見圖2。

1.2.5 培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后，取出培養(yǎng)皿測量大麥粒的菌落直徑，采用卡尺以十字交叉法測量每個(gè)大麥粒的2個(gè)直徑，每皿4個(gè)大麥粒一共測量8個(gè)數(shù)據(jù)，以其均數(shù)代表菌落大小。用以下公式計(jì)算各藥劑處理對病菌菌絲生長的抑菌率：菌絲生長抑制率（%）=（1-處理菌落直徑/對照菌絲生長）×100%。

1.2.6 根據(jù)各藥劑濃度對數(shù)值及對應(yīng)的菌絲生長抑制率幾率值作回歸分析，利用DPS分析軟件計(jì)算出回歸方程，求出抑制孢子萌發(fā)的藥液濃度。

圖1 培養(yǎng)皿十字刻度板示范

圖2 菌絲抑制效果

2 討論

大麥粒放置在培養(yǎng)皿中相對于牛津杯的菌餅操作更加簡單方便，一瓶茄形培養(yǎng)瓶既可培養(yǎng)千粒以上大麥粒，而菌餅培養(yǎng)上千個(gè)至少需要幾十個(gè)培養(yǎng)皿，耗時(shí)耗材，另外在接菌到培養(yǎng)基的過程中，大麥粒的操作也較之菌餅簡單易行，同時(shí)也減少操作的污染。

大麥粒培養(yǎng)菌絲的優(yōu)點(diǎn)，大麥粒菌絲的生長為立體三維的全方位生長，生長均勻，不同于菌餅生長為單面生長，接菌后大麥粒擴(kuò)展菌絲也會(huì)較菌餅擴(kuò)展的更加均勻。

塑料圓形十字刻度板底為白色，刻度為黑色，使用時(shí)將圓形刻度板放置于培養(yǎng)皿外側(cè)底部，此種操作方便不易造成污染，可透過培養(yǎng)基看到底部進(jìn)行操作。

綜上所述，本發(fā)明的技術(shù)方案可大大提高稻瘟病殺菌劑篩選的效率，利于大批量快速篩選稻瘟病殺菌劑。