雄激素受體αA基因甲基化和tHcy對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的影響

黃毓娟，萬里，楊志宏，沈舒文，4

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046；2.西安大興醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安710016；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科，陜西咸陽(yáng)712046；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)系，陜西咸陽(yáng)712046

前言

缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)是動(dòng)脈硬化，動(dòng)脈硬化是造成心腦血管疾病和死亡的重要因素。大量結(jié)果表明，雄激素受體αA（Androgen reciptor-αA,AR-αA）基因表達(dá)下調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化患者粥樣斑塊的發(fā)生相關(guān)，本課題組進(jìn)一步研究表明，AR-αA基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島存在的高甲基化可能使AR 基因表達(dá)沉默，從而致腦梗死發(fā)病，同時(shí)血液總同型半胱氨酸（total Homocysteinet, tHcy）的增高可以調(diào)控AR-αA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化強(qiáng)度［1-2］。

國(guó)內(nèi)研究表明，顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄是中國(guó)人缺血性腦血管事件發(fā)生的主要原因，而國(guó)外相關(guān)研究認(rèn)為，引起狹窄的斑塊性質(zhì)可能是決定缺血性腦卒中反復(fù)發(fā)作和進(jìn)展的重要因素。由于斑塊的成分不同，導(dǎo)致其在磁共振成像下的成像過程中，出現(xiàn)不同信號(hào)的斑塊，為繼續(xù)探究基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與缺血性腦卒中之間的關(guān)系，因此決定利用1.5 T高分辨率磁共振成像（High-Resolution Magnetic Resonance Ⅰmaging,HR MRⅠ）作為檢查手段，探討顱內(nèi)動(dòng)脈大腦中動(dòng)脈M1段斑塊性質(zhì)與基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化、tHcy 之間的關(guān)系，是否存在AR-αA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）的過度增殖與遷移，這種變化是否導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、斑塊的形成，導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄，VSMC的過度增殖與遷移是否可以導(dǎo)致斑塊的繼發(fā)性改變，理論闡明易損斑塊的分子生物學(xué)形成機(jī)制。本研究在HR MRⅠ顱內(nèi)成像基礎(chǔ)上，用臨床病例進(jìn)行研究，并討論AR-αA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與顱內(nèi)動(dòng)脈不同信號(hào)斑塊的內(nèi)在生物學(xué)關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

試驗(yàn)組：納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均為急性缺血腦卒中，年齡≥18 歲，發(fā)病時(shí)間≤7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：心源性腦梗死、頸部血管及雙下肢血管狹窄率＞50%、無癥狀及體征的腦梗死、不能完成核磁共振檢查者，一般情況登記。輔助檢查：心臟結(jié)構(gòu)及功能評(píng)價(jià)，包括心臟彩超、心電圖、頸部血管彩超、雙下肢血管彩超。

對(duì)照組：納入標(biāo)準(zhǔn)：非急性腔隙性腦梗死，時(shí)間≥7 d，年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2 顱腦HR MRⅠ的大腦中動(dòng)脈（Middle Cerebral Artery,MCA）斑塊檢查

影像采集：采用Philips（荷蘭）1.5 T磁共振（MR）系統(tǒng)，切換率50 mT/ms，8通道掃描線圈。參與實(shí)驗(yàn)的患者均進(jìn)行常規(guī)頭顱MR掃描，掃描的序列及參數(shù)：橫截面T1W1（TR 400 ms，TE 15 ms，T11 150 ms）、T2W1（TR 4 000 ms，TE 120 ms）、T2-FLAⅠR（TR 9 000 ms，TE 120 ms，T12 600 ms）、DWⅠ（b=1 000 s/mm2，TR 3 000 ms，TE 87 ms），及矢狀面T2W1（TR 3 000 ms，TE 90 ms），厚度5 mm，層間距1.5 mm，F(xiàn)OV 240 mm×240 mm，矩陣320×256，使用造影劑釓噴酸葡胺，劑量為0.1 mmol/kg進(jìn)行磁共振血管造影（Magnetic Resonance Angiography,MRA）及T1VⅠSTA HR MRⅠ；1.5T MR進(jìn)行頭顱HR MRⅠ檢查顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊至狹窄處，明確不同信號(hào)強(qiáng)度的斑塊，以周圍肌肉組織信號(hào)作為對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組分為高信號(hào)或混雜信號(hào)組、等信號(hào)或低信號(hào)組。

圖像分析標(biāo)準(zhǔn)：HR MRⅠ評(píng)估腦動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性具有較高的可信度［3］。目前認(rèn)為HR MRⅠ檢查中T1WⅠ序列，參考斑塊病理學(xué)變化可以更好地解釋HR MRⅠ圖像的意義。高低信號(hào)主要是相對(duì)于周圍肌肉組織而言，如纖維帽在T1、T2序列呈高信號(hào)，高于周圍肌肉信號(hào)2倍以上［4］；斑塊內(nèi)出血在T1加權(quán)項(xiàng)呈高信號(hào)，呈高亮狀態(tài)，與周圍肌肉組織形成鮮明對(duì)比［5］；脂質(zhì)核心在T1、T1加權(quán)和T2、T2*呈現(xiàn)高信號(hào)［6-7］；鈣化在T1、T2序列呈低信號(hào)，信號(hào)比肌肉暗［8］。由2位高年資影像醫(yī)師雙盲分析各序列斑塊的分布及信號(hào)特點(diǎn)，進(jìn)行分組。

1.3 標(biāo)本的采集

抽取參與者清晨空腹肘靜脈血4 mL，2 mL 血用于檢測(cè)血tHcy 濃度；2 mL 血用來提取基因組DNA，檢測(cè)甲基化程度，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AR-αA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)

提取DNA 及其甲基化修飾、純化與吸收：用DNA Methylation TM Kit試劑盒（購(gòu)自美國(guó)ZYMO 公司），嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作；取5 μL M-Dilution Buffer添加到14 μL 的DNA 標(biāo)本中，用無菌雙蒸水調(diào)整使總?cè)萘繛?0 μL，輕彈混合后室溫在37 ℃水浴箱孵育15 min，使DNA變性。合格標(biāo)本中加入CT試劑100 μL混合。避光下，50 ℃孵育14 h；4 ℃孵育10 min；取400 μL M-Binding Buffer 加入ⅠC 管中，ⅠC 管放入已提供的集合管中。上述標(biāo)本入ⅠC 管中，搖床混勻后進(jìn)行全速離心，時(shí)間為30 s，棄去上清液。取MWash Buffer 100 μL置入至ⅠC管中，全速離心30 s。取200 μL M-Desulphonation Buffer 加入ⅠC 管中，室溫靜置15～20 min 孵育，全速離心，時(shí)間為30 s。取MWash Buffer加入ⅠC管中200 μL，行全速離心，時(shí)間為30 s，再取M-Wash Buffer 200 μL，將其加入至ⅠC管中進(jìn)行全速離心，離心時(shí)間為30 s。之后置入ⅠC 管于微離心管中，取M-Elution Buffer 10 μL 直接懸滴入ⅠC管中，全速離心，時(shí)間為30 s，之后進(jìn)行洗提。

甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（Methylation Specific Polymerase Chain Reaction,MSP）引物設(shè)計(jì)：引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物的合成批號(hào)分別為：20180512、20180515、20180516，ARαA基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）引物如表1所示。

表1 AR-αA基因PCR引物Tab.1 PCR primers of androgen reciptor-αA(AR-αA)gene

AR-αA基因PCR 方法及步驟：反應(yīng)體系：含修飾DNA模板2 μL，包括Taq 酶0.1 U/μL，dNTP 500 μmol/L，20 mmol/L HCl，pH 8.3；100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，引物各0.3 μL，加無菌雙蒸水，總體積共12.5 μL。94 ℃5 min，65 ℃30 s，72 ℃1 min，20 個(gè)循環(huán)，72 ℃7 min，結(jié)束反應(yīng)。得到PCR產(chǎn)物模板。AR-PN、AR-PM、AR-PU按上述反應(yīng)體系擴(kuò)增。在1%的瓊脂糖凝膠上，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行觀察并拍照存檔。檢測(cè)方法：熒光生化法檢測(cè)血tHcy水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，年齡進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

在tHcy 患者中，高信號(hào)或混雜信號(hào)斑塊患者40例（95.2%），明顯多于等信號(hào)或低信號(hào)患者20 例（74.1%），也顯著高于對(duì)照組18例（60.0%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.49,P=0.023）。其他各項(xiàng)臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 受試者的臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical information among 3 groups of subjects

2.2 影像學(xué)結(jié)果

在觀察69 例患者的雙側(cè)大腦中動(dòng)脈M1段可見斑塊101處；其中42例患者高信號(hào)或混雜信號(hào)42處，27 例患者中等信號(hào)或低信號(hào)59 處。典型病例如圖1～圖3所示。

圖1 70歲男性的中動(dòng)脈供血區(qū)腦梗死左腦斑塊Fig.1 Left cerebral plaque in a 70-year-old male patient with cerebral infarction in the blood supply area of the middle cerebral artery

2.3 MSP結(jié)果

通過電流得到甲基化結(jié)果，電泳產(chǎn)物大小為130 bp。高信號(hào)或混雜信號(hào)組血液AR-αA基因啟動(dòng)子甲基化水平高于其他兩組；而等信號(hào)或低信號(hào)組甲基化水平高于對(duì)照組（圖4）。

圖2 患有短暫性腦缺血的60歲男性患者Fig.2 60-year-old male patient with transient ischemic attack

圖3 63歲男性的腦梗塞-RMCA供血區(qū)腦梗死Fig.3 63-year-old male patient with cerebral infarction in RMCA blood supply area

圖4 MSP法檢測(cè)AR-αA基因啟動(dòng)子甲基化電泳圖Fig.4 Electropherogram of the methylation of AR-αA gene promoter detected by methylation specific polymerase chain reaction

2.4 不同性質(zhì)斑塊的甲基化率比較

甲基化檢測(cè)表明，等信號(hào)或低信號(hào)組標(biāo)本中有19 例發(fā)生了甲基化，占比70.4%；高信號(hào)或混雜信號(hào)組標(biāo)本中發(fā)生甲基化者33 例，占比為78.6%；正常對(duì)照組發(fā)生甲基化者8 例，占比26.6%。3 組對(duì)比差異有顯著性意義（P＜0.001，表3）。

2.5 甲基化與tHcy水平的關(guān)系

按甲基化程度不同將入組患者分為3 組，tHcy（μmol/L）在其中的水平差異較大，即完全甲基化組43 例，tHcy 水平為（13.2±4.7）μmol/L、半甲基化組17例，tHcy 水平為（19.8±4.2）μmol/L，均高于非甲基化組39例，tHcy水平為（3.2±4.7）μmol/L，組間對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法對(duì)AR-αA基因甲基化程度與tHcy 水平進(jìn)行分析，二者存在不完全相關(guān)且為正相關(guān)（r=0.549,P＜0.05），根據(jù)雙側(cè)顯著性值小于0.01，可見甲基化程度與tHcy水平存在顯著相關(guān)關(guān)系，提示高tHcy 與AR-αA基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化有關(guān)系。

表3 3組樣本甲基化率的比較（例）Tab.3 Comparison of methylation rates in 3 groups(cases)

2.6 甲基化與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄率的關(guān)系

3 組與管腔狹窄率比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明管腔狹窄與AR-αA基因啟動(dòng)子甲基化程度不同（表4）。

表4 管腔狹窄率比較（例）Tab.4 Comparison of rate of arterial stenosis(cases)

3 討論

在血管阻塞性疾病中病理解剖可以顯示平滑肌細(xì)胞的過度增生，多項(xiàng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雄激素可以抑制VSMC 的增殖和新的血管內(nèi)膜出現(xiàn)［9］。中國(guó)成年人顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣斑塊普遍存在，MCA 和后循環(huán)即椎動(dòng)脈（Vertebral Artery, VA）、基底動(dòng)脈（Basilar Artery,BA）板塊形態(tài)性質(zhì)不同，斑塊新生毛細(xì)血管、斑塊出血是MCA、BA 及VA 斑塊的普遍特點(diǎn)，脂質(zhì)核心是MCA 的特點(diǎn)，鈣化多出現(xiàn)在顱內(nèi)動(dòng)脈后循環(huán)［10］。顱內(nèi)動(dòng)脈斑塊的解剖和病理類型研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動(dòng)脈斑塊在人群中普遍存在，MCA、VA、BA 的管壁病變不同，MCA 主要為偏心斑塊，與VA、BA進(jìn)行比較存在差異［11］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果從生物學(xué)角度顯示了tHcy 對(duì)AR-αA基因啟動(dòng)子的甲基化的調(diào)控作用；AR-αA基因啟動(dòng)子的甲基化受到體內(nèi)tHcy 的調(diào)控，tHcy 調(diào)控AR-αA基因啟動(dòng)子的甲基化可能是通過氧化應(yīng)激作用［12］。有研究表明，高tHcy時(shí)，tHcy長(zhǎng)期作用于內(nèi)皮細(xì)胞使內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）受損，eNOS 基因表達(dá)減少，會(huì)加速NO 降解，使得保護(hù)機(jī)制喪失，其中心致病機(jī)制可能主要與tHcy 引起的游離自由基生成增多及氧化應(yīng)激有關(guān)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因啟動(dòng)子序列DNA 甲基化程度隨tHcy 濃度的升高而增加［13］。本研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者的血清tHcy 水平顯著高于正常人，且同AR-αA基因啟動(dòng)子的甲基化程度呈正相關(guān)，這可能是易損斑塊形成的重要環(huán)節(jié)。

斑塊性質(zhì)不同，AR-αA基因啟動(dòng)子的甲基化程度不同，而且有顯著的差異性且呈正相關(guān)性；AR-αA基因啟動(dòng)子的高甲基化可使AR-αA基因沉默，雄激素激活A(yù)R-αA后，可以減慢由于血管壁損傷引起VSMC的增殖［14］。

環(huán)境因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，高血壓、高血脂及tHcy 等引起的血流動(dòng)力學(xué)改變，造成動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，內(nèi)皮損傷在修復(fù)過程中引起動(dòng)脈管壁增厚變硬，有研究認(rèn)為，血流動(dòng)力學(xué)原因會(huì)加大顱內(nèi)最大動(dòng)脈管壁前壁側(cè)的壓力，導(dǎo)致大腦中動(dòng)脈容易發(fā)生斑塊粥樣硬化斑塊［15-16］，而基因水平上因AR-αA基因沉默會(huì)使血管內(nèi)皮損傷處的VSMC 過度增殖而形成斑塊，再出現(xiàn)斑塊繼發(fā)性改變。不穩(wěn)定斑塊與AR-αA基因啟動(dòng)子的甲基化程度、tHcy 均呈正相關(guān)；有關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AR-αA均有抑制VSMC 增殖和遷移的能力。斑塊信號(hào)強(qiáng)度升高與吸煙史、高血壓病史和糖尿病史有相關(guān)的趨勢(shì)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能統(tǒng)計(jì)樣本不夠大；高tHcy 患者與斑塊信號(hào)強(qiáng)度及甲基化程度呈密切正相關(guān)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此認(rèn)為，外在環(huán)境導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，在血管內(nèi)皮修復(fù)過程中由于AR-αA基因啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的異常增殖，使斑塊的不穩(wěn)定性增加。

顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄是中國(guó)人缺血性腦血管病發(fā)病的一個(gè)主要原因［17-18］，本研究利用HR MRⅠ技術(shù)和nMSP 的方法揭示AR-αA基因啟動(dòng)子甲基化與顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的關(guān)系，表明易損斑塊導(dǎo)致的狹窄是由于機(jī)體環(huán)境和表觀遺傳學(xué)的共同結(jié)果，防治顱內(nèi)血管病變表觀遺傳學(xué)是否可以提供有益的臨床預(yù)測(cè)效果還需臨床循證醫(yī)學(xué)的支持，以及對(duì)顱內(nèi)斑塊的深入認(rèn)識(shí)還需從病理學(xué)上認(rèn)識(shí)斑塊，以更好地解釋影像圖像，結(jié)合分子生物學(xué)更好地認(rèn)識(shí)和判定斑塊的形態(tài)和風(fēng)險(xiǎn)，本次初步了解易損斑塊的形成是多種因素合力的結(jié)果。目前國(guó)際上已開始7T MR 超導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)斑塊形態(tài)學(xué)的研究，同時(shí)嘗試對(duì)顱內(nèi)后循環(huán)血管壁情況的探查，期待在未來，高分辨率能對(duì)斑塊的認(rèn)識(shí)更加深入，更好地指導(dǎo)臨床與疾病的研究［19-20］。同時(shí)，本次研究對(duì)象皆為咸陽(yáng)地區(qū)人口，結(jié)果顯示咸陽(yáng)地區(qū)顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的患者中，87%的患者患有高tHcy 血癥，體檢的過程中發(fā)現(xiàn)60%健康人群患有tHcy 血癥，遠(yuǎn)高于其他地區(qū)30%的發(fā)病率，顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄不同的原因可能是地域不同，這還有待進(jìn)一步調(diào)查。同時(shí)本研究對(duì)大腦中動(dòng)脈、椎動(dòng)脈、基底動(dòng)脈的斑塊形態(tài)和性質(zhì)與AR-αA基因甲基化和tHcy 的相關(guān)性沒有研究，后續(xù)研究還需要進(jìn)一步的研究。