Smile來源的角膜基質(zhì)透鏡構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)支架的實(shí)驗(yàn)研究

葉 青，Ackbarkhan Zacharia，紀(jì)佳月，曾 靜

0引言

角膜病是世界第四大致盲性疾病[1]，角膜移植是角膜病重要的復(fù)明及治療手段。角膜存在的“免疫赦免”機(jī)制，使得角膜移植術(shù)成為成功率最高的器官移植手術(shù)，但角膜病變時(shí)常伴有強(qiáng)烈且持續(xù)的炎癥反應(yīng)，因此角膜移植術(shù)后仍可出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。近年來，關(guān)于角膜移植的熱點(diǎn)問題主要集中在兩個(gè)方面：(1)如何擴(kuò)增角膜供體來源；(2)如何減輕或避免移植后排斥反應(yīng)。角膜供體的缺乏使得研究者致力于開發(fā)角膜替代物。組織工程角膜利用生物學(xué)、材料學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等知識(shí), 構(gòu)建具有良好生物相容性的種子細(xì)胞-生物材料支架的復(fù)合體。在多種生物支架材料中，豬角膜基質(zhì)由于僅表達(dá)少量異種糖原抗體，且膠原的物種差異較小，因此成為目前研究最多的支架材料之一[2]。但豬角膜基質(zhì)存在宗教或倫理道德的限制，以及感染異種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，臨床實(shí)際應(yīng)用受限。隨著全飛秒激光小切口微透鏡摘除術(shù)(small incision lenticule extraction，Smile)的興起，術(shù)中取出的光滑平整的人角膜基質(zhì)透鏡，為組織工程角膜提供了更優(yōu)的同種角膜基質(zhì)組織材料來源。本研究利用人纖維蛋白粘合劑(fibrin sealant，F(xiàn)S)粘貼Smile術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡，構(gòu)建雙層角膜基質(zhì)透鏡支架，探究不同保存方式對(duì)支架硬度、穩(wěn)定性、透明度的影響；此外，從細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等方面評(píng)估FS對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞(human corneal fibroblasts，HCFs)的毒性作用，以期為臨床提供一種安全無毒、簡(jiǎn)單易得的組織工程角膜支架材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器纖維蛋白粘合劑(RAAS)，Ι型膠原酶(Sigma)，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)，MTT試劑盒(Multi Sciences)，無水甘油(Solarbio)，透明質(zhì)酸鈉(Santen)；酶標(biāo)分析儀(Thermo)，熒光顯微鏡(Nikon)，眼科手術(shù)顯微鏡(Zeiss)。

1.1.2組織來源人角膜基質(zhì)透鏡取自2019-01/03于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科行Smile術(shù)的近視患者97例194眼，其中男46例，女51例，年齡19～36歲，均排除其他眼部及全身疾病。角膜基質(zhì)透鏡取出后立即置于無菌RPMI-1640培養(yǎng)基，于2h內(nèi)轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)。編號(hào)并記錄患者的姓名、性別、年齡、術(shù)前屈光度、角膜基質(zhì)透鏡的直徑及中央厚度。本次研究已通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2方法

1.2.1 HCFs體外分離和培養(yǎng)由于Smile手術(shù)是直接在角膜基質(zhì)層做預(yù)設(shè)深度的切削，取出的組織僅有角膜基質(zhì)組織，而角膜基質(zhì)組織主要是由大量的膠原纖維和成纖維細(xì)胞構(gòu)成的，因此用Ι型膠原酶消化取出的角膜基質(zhì)組織，將得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行體外培養(yǎng)后，得到的細(xì)胞即是基質(zhì)層來源的角膜成纖維細(xì)胞。將術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡置于PBS緩沖液中洗滌2～3次，用1.5g/L Ⅰ型膠原酶溶液于37℃消化至組織塊溶解，1000r/min離心5min，棄上清，將細(xì)胞稀釋后接種于培養(yǎng)瓶，2～3d換液1次，約7d后按1∶3接種傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率將纖維蛋白粘合劑置于15mL完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，于37℃恒溫箱中72h，收集浸提液。以3 000個(gè)/孔的密度將HCFs接種于96孔板，于37℃培養(yǎng)。24h后按以下分組全量換液：(1)浸提液組：每孔100μL 浸提液；(2)完全培養(yǎng)基組：每孔100μL完全培養(yǎng)基；(3)空白對(duì)照組：無細(xì)胞，每孔100μL完全培養(yǎng)基。分別于換液24、36、48、60、72h后檢測(cè)各組在570nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)生存率(RGR)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并參照細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞相對(duì)生存率RGR(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)/(正常對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.2.3角膜基質(zhì)支架的制備將術(shù)中取出的同一患者來源的兩片角膜基質(zhì)透鏡平鋪于清潔蓋玻片上，吸除周圍殘留的RPMI-1640培養(yǎng)基。于手術(shù)顯微鏡下，先后滴加等量(3～5μL)纖維蛋白粘合劑、凝血酶溶液于其中一片角膜基質(zhì)透鏡表面，并迅速將另一片透鏡覆蓋其上，于10s內(nèi)調(diào)整至兩片透鏡完全重疊。

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)

等級(jí)RGR(%)細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞增殖能力毒性作用0≥100細(xì)胞形態(tài)完整,貼壁良好,無細(xì)胞溶解優(yōu)-180～99少于20%的細(xì)胞呈圓形,貼壁松散,無胞漿顆粒,偶見細(xì)胞溶解優(yōu)-250～79少于50%的細(xì)胞呈圓形,無胞漿顆粒,可見明顯細(xì)胞溶解良+330～49少于70%的細(xì)胞呈圓形或溶解中++40～29幾乎所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)均不完整差+++

表2 培養(yǎng)不同時(shí)間浸提液組與完全培養(yǎng)基組細(xì)胞的OD值與細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)

培養(yǎng)時(shí)間浸提液組(x±s)完全培養(yǎng)基組(x±s)RGR(%)等級(jí)毒性作用24h0.513±0.0470.524±0.08097.801-36h0.723±0.0560.662±0.057109.420-48h0.880±0.1020.844±0.107104.570-60h0.946±0.0981.040±0.07591.041-72h1.109±0.0551.204±0.34392.131-

1.2.4不同保存介質(zhì)對(duì)支架的影響將36枚雙層角膜基質(zhì)透鏡支架轉(zhuǎn)移至6孔板中，按照保存介質(zhì)不同分為以下4組：無水甘油組、透明質(zhì)酸鈉組、胎牛血清組及模擬濕房環(huán)境組(生理鹽水浸濕的棉球)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔放置3枚基質(zhì)透鏡支架。將6孔板置于4℃環(huán)境保存14d，觀察并評(píng)價(jià)透鏡支架的硬度、透明度及穩(wěn)定性(以開裂情況作為穩(wěn)定性判斷標(biāo)準(zhǔn))，硬度和透明度均在眼前段相機(jī)下進(jìn)行直觀評(píng)判。

1.2.5不同保存溫度對(duì)支架的影響將45枚雙層角膜基質(zhì)透鏡隨機(jī)分為3組，置于無水甘油中脫水，其中15枚支架于常溫(25℃)環(huán)境保存(常溫組)，15枚支架于4℃環(huán)境中保存(4℃組)，15枚支架于-20℃環(huán)境中保存(-20℃組)。14d后復(fù)水，并觀察比較3種溫度保存的支架硬度、透明度及穩(wěn)定性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用Fisher確切概率法；等級(jí)資料的組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，若組間存在差異，再采用Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HCFs的形態(tài)特征細(xì)胞種瓶后24h，大部分HCFs貼壁，約48h后可見HCFs伸展為長(zhǎng)梭形或三角形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核仁清晰，貼壁緊密，排列整齊，呈渦旋狀生長(zhǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率倒置相差顯微鏡下可見浸提液組和完全培養(yǎng)基組細(xì)胞均具有正常的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁良好、形狀完整，無胞漿顆粒。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，0～72h內(nèi)浸提液組與完全培養(yǎng)基組細(xì)胞具有相似的增殖趨勢(shì)。浸提液組細(xì)胞培養(yǎng)36～48h細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為0級(jí)，24h內(nèi)及60～72h細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為1級(jí)，0～72h細(xì)胞相對(duì)生存率均超過90%(表2，圖1)。按照美國藥典的毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，RGR≥80%即可認(rèn)為材料無毒。

2.3雙層角膜基質(zhì)支架的構(gòu)建用纖維蛋白粘合劑粘貼后的雙層角膜基質(zhì)透鏡支架表面平整光滑，厚度及硬度增加，透明度良好，雙層透鏡間貼合緊密。

2.4不同保存介質(zhì)對(duì)雙層透鏡支架的影響4℃保存14d后，無水甘油組9枚雙層基質(zhì)透鏡支架復(fù)水后均未出現(xiàn)開裂情況，透明度良好，硬度較甘油保存前增加，厚度稍增加(圖2A)；透明質(zhì)酸鈉組9枚支架中，3枚出現(xiàn)開裂，剩余6枚完整，透明度尚可，硬度較保存前下降，支架略呈水腫狀態(tài)，厚度增加(圖2B)；模擬濕房環(huán)境組9枚支架均無開裂現(xiàn)象，但存在不同程度的皺縮，表面粗糙不平，厚度及透明度均較保存前降低(圖2C)；胎牛血清組9枚支架全部開裂，單層基質(zhì)透鏡質(zhì)軟且水腫嚴(yán)重。以4℃保存14d后雙層角膜基質(zhì)透鏡支架開裂情況為判斷標(biāo)準(zhǔn)，比較4種保存方式的穩(wěn)定性，無水甘油和濕房保存的支架穩(wěn)定性最高，均優(yōu)于透明質(zhì)酸鈉，而胎牛血清保存的支架穩(wěn)定性最低(P<0.05，表3)。

圖1 HCFs在纖維蛋白粘合劑作用下的生長(zhǎng)曲線。

2.5不同保存溫度對(duì)雙層透鏡支架的影響于常溫、4℃及-20℃的無水甘油中保存14d后，各組雙層角膜基質(zhì)透鏡復(fù)水后硬度相似，但透明度及顏色出現(xiàn)明顯差異。于常溫?zé)o水甘油中保存的15枚雙層透鏡支架，其中2枚保持無色透明，5枚輕微變黃但透明度尚可，8枚嚴(yán)重變黃且透明度明顯降低；于4℃無水甘油中保存的15枚雙層透鏡支架，其中5枚保持無色透明，10枚輕微變黃且透明度良好；于-20℃無水甘油中保存的15枚雙層透鏡支架均保持無色透明狀態(tài)，未出現(xiàn)變黃情況。以保存14d后雙層角膜基質(zhì)透鏡支架透明度情況為判斷標(biāo)準(zhǔn)，比較3種保存溫度的保存效果，不同溫度的無水甘油對(duì)雙層角膜基質(zhì)透鏡支架的保存效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中常溫組和4℃組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，-20℃組與其余兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P<0.05)，表明-20℃組的保存效果最佳(表4)。

圖2 不同保存介質(zhì)對(duì)雙層透鏡支架的影響 A：無水甘油組，雙層角膜基質(zhì)透鏡支架復(fù)水后，未出現(xiàn)開裂情況，透明度良好，硬度較保存前增加，厚度稍增加；B：透明質(zhì)酸鈉組，透明質(zhì)酸鈉中保存14d的雙層角膜基質(zhì)透鏡透明度尚可，硬度較保存前降低，支架呈水腫狀態(tài)，厚度增加；C：模擬濕房環(huán)境組，模擬濕房環(huán)境保存14d的雙層角膜基質(zhì)透鏡透明度欠佳，存在不同程度皺縮，表面粗糙不平，厚度及硬度均較保存前降低。

表3 不同保存介質(zhì)對(duì)雙層角膜基質(zhì)透鏡支架穩(wěn)定性的影響 枚

組別n開裂未開裂無水甘油組909透明質(zhì)酸鈉組936模擬濕房環(huán)境組909胎牛血清組990

表4 不同保存溫度對(duì)雙層角膜基質(zhì)透鏡支架透明度的影響 枚

組別n-+++常溫組152584℃組155100-20℃組151500

注：-：無色透明；+：透明但輕微變黃；++：嚴(yán)重變黃且透明度降低。

3討論

角膜基質(zhì)是維持角膜透明性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，因此，尋找具有類似天然角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)和生化成分的角膜基質(zhì)替代物是組織工程角膜研發(fā)的重點(diǎn)之一[3]。理想的角膜基質(zhì)支架材料應(yīng)具有材料透明、良好的生物相容性、適宜的強(qiáng)度、良好的穩(wěn)定性，可供細(xì)胞黏附、增殖和遷移等特點(diǎn)[4]。目前研究最多的支架材料主要有膠原及其復(fù)合物、脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、絲素蛋白、纖維蛋白、殼聚糖等[5]。在多種支架材料中，脫細(xì)胞角膜基質(zhì)來源于天然的角膜組織，既保留了角膜組織的結(jié)構(gòu)及組成成分，還保留了上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的附著位點(diǎn)，因此成為支架材料的理想選擇。但傳統(tǒng)的脫細(xì)胞基質(zhì)主要來源于豬的角膜組織，存在一定的宗教及倫理學(xué)爭(zhēng)議，且存在感染異種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床實(shí)際應(yīng)用受限。

Smile術(shù)的興起為角膜基質(zhì)材料提供了新的來源。Smile是在角膜基質(zhì)層進(jìn)行兩次預(yù)設(shè)深度和弧度的掃描切削，分離透鏡前后表面后，將透鏡從小切口完整取出。取出的角膜基質(zhì)透鏡前后表面光滑平整，因直接取自于人的角膜基質(zhì)層，理論上保留了正常角膜基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)、光學(xué)透明度、生物力學(xué)強(qiáng)度及生物相容性。單層角膜基質(zhì)透鏡厚度約100μm，可承受的眼內(nèi)壓有限，因此對(duì)于3mm以上(<5mm)的較大角膜穿孔，可疊加使用多層角膜基質(zhì)透鏡作為支架材料，以提高支架材料的抗張強(qiáng)度。FS是從健康人的血漿中提取出的一種天然的生物蛋白粘合劑，呈透明凝膠狀，多用于手術(shù)中噴灑創(chuàng)面使組織黏附并止血[6-9]，因此可選用FS粘貼多層角膜基質(zhì)透鏡，以適應(yīng)不同程度角膜穿孔的抗張強(qiáng)度需求。為探究FS對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞的毒性影響，本研究將Smile來源的角膜成纖維細(xì)胞與FS浸提液共同培養(yǎng)72h，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，證實(shí)FS對(duì)角膜成纖維細(xì)胞無毒性作用，具有良好的生物相容性，可用于構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)支架。FS粘貼的雙層角膜基質(zhì)透鏡支架表面光滑平整，硬度增加，透明度良好，兩片透鏡貼合緊密，不易移位。

傳統(tǒng)的角膜保存方法主要分為短期、中期、長(zhǎng)期及超長(zhǎng)期保存法[10]。短期保存一般采用濕房保存的方式，保存時(shí)間較短，一般為24～48h；中期保存主要是用角膜中期保存液將角膜保存4～14d，中期保存液中一般添加有硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸鈉、自體或受體血清、青霉素及皮質(zhì)類固醇等添加劑以延長(zhǎng)保存時(shí)間；長(zhǎng)期保存多采用器官培養(yǎng)法，但此法操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，國內(nèi)應(yīng)用較少；超長(zhǎng)期保存則多采用甘油保存法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，且可將保存時(shí)間延長(zhǎng)至數(shù)年[11]。綜合考慮上述保存方式，本研究選擇無水甘油、透明質(zhì)酸鈉、胎牛血清及模擬濕房環(huán)境作為角膜支架的保存介質(zhì)，以探究角膜支架的適宜保存方式。通過對(duì)比不同保存介質(zhì)中支架的透明度、開裂情況、硬度及厚度，證實(shí)無水甘油是雙層角膜基質(zhì)支架的較佳保存介質(zhì)。通過進(jìn)一步對(duì)比常溫、4℃及-20℃無水甘油中保存的透鏡支架的透明度，證實(shí)-20℃是較佳保存溫度。在-20℃無水甘油中保存的角膜基質(zhì)透鏡支架復(fù)水后，其硬度、厚度、透明度及穩(wěn)定性均較好。

綜上所述，本研究利用FS粘貼Smile來源的角膜基質(zhì)透鏡構(gòu)建雙層角膜基質(zhì)透鏡支架，為組織工程角膜支架材料提供了新的來源途徑。將Smile來源的角膜基質(zhì)細(xì)胞與FS浸提液共培養(yǎng)，通過MTT法證實(shí)FS對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞無毒性作用，可用于構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)支架。通過對(duì)比不同保存介質(zhì)、不同保存溫度下透鏡支架的穩(wěn)定性、硬度及透明度，證實(shí)-20℃無水甘油是雙層角膜基質(zhì)透鏡較為理想的保存條件。不僅擴(kuò)充了角膜支架材料的來源，可直接用于修補(bǔ)3mm以下的角膜穿孔，而且為下一步聯(lián)合種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程角膜提供了前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。