初級纖毛參與成纖維細胞生長因子18介導的軟骨細胞增殖和表型調控的機制研究

陶鳳華 蔣婷 向威

骨關節(jié)炎是一類因軟骨損傷退變引起的關節(jié)疾病，常伴有軟骨基質的分解代謝增強和不恰當?shù)膿p傷修復，其病理表現(xiàn)主要為進行性的軟骨丟失，軟骨下骨硬化和骨贅形成，能引起受累關節(jié)的疼痛和功能障礙，影響病人生活質量［1］。目前，藥物治療雖然能夠緩解骨關節(jié)炎引起的疼痛癥狀，但卻不能阻斷其疾病進程。而改善疾病的骨關節(jié)炎藥物（disease?modifying osteoarthritis drugs, DMOADs）能夠通過抑制軟骨的分解代謝，同時促進合成代謝來阻斷軟骨組織的退變并且促進其再生，不僅能緩解疼痛癥狀，還能促進軟骨結構改善和功能恢復，具有重要的研究意義［2］。

成纖維細胞生長因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）是成纖維細胞生長因子家族中的一類亞型，在調控骨骼系統(tǒng)的發(fā)育過程中扮演著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18 能夠維持軟骨細胞內穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定，減少因軟骨損傷導致的軟骨厚度和體積的丟失，并且促進軟骨損傷的愈合及再生軟骨的整合［3，4］。FGF18 主要通過與成纖維細胞生長因子受體3（FGFR3）結合參與FGF 信號通路轉導來發(fā)揮其生長發(fā)育調控作用［5］。與其他DMOADs 相比，F(xiàn)GF18對軟骨細胞的促合成代謝作用伴有較少的副反應，如較少引起骨贅形成、軟骨鈣化和炎癥等［6］。目前FGF18 在臨床應用的價值不斷得到重視，但是其改善骨關節(jié)炎的潛在機制仍有待進一步研究。

初級纖毛作為凸出于細胞表面的“天線”樣結構，是一類具有特殊功能的細胞器，能夠參與感受細胞微環(huán)境中的理化刺激并介導多種信號通路的轉導，其組裝聚合過程還與細胞周期相關，參與細胞的生長發(fā)育調控［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，初級纖毛能夠作為調節(jié)生長板功能和骨骼系統(tǒng)發(fā)育重要的信號轉導樞紐［8］。同時，初級纖毛參與細胞新陳代謝，與代謝相關的細胞自噬具有明顯的關聯(lián)性［9］。并且初級纖毛結構和功能的完整性還能夠影響力學刺激對軟骨細胞生長發(fā)育的調控［10］。

本研究探究了不同濃度的FGF18 對軟骨細胞增殖和分化的影響，通過使用水合氯醛調控初級纖毛結構，再結合FGF18 干預，探索FGF18 在不同纖毛表達條件下對軟骨細胞生長發(fā)育的影響，旨在闡明初級纖毛在FGF 18 調控軟骨細胞發(fā)育中的作用及機制。

材料與方法

一、實驗材料與儀器

SD 大鼠乳鼠購自武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心，水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司，胎牛血清購自美國Gibco Life Technologies 公司，小鼠源acetylated?α?tubulin 抗體購自美國Sigma 公司，DMEM/F12 細胞培養(yǎng)基、小鼠源GAPDH 抗體、兔源CyclinD1 抗體、CY?3 標記的熒光二抗、辣根過氧化物酶標記的二抗、Western blot凝膠配制試劑盒、ECL顯色液、甲苯胺藍染液、CCK8等均購自武漢博士德公司，兔源COL Ⅱ抗體購自英國Abcam 公司，兔源ERK 和P?ERK 抗體購自美國CST 公司，Live/dead 試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，PCR 逆轉錄試劑盒和SYBR?Green DNA 聚合酶均購自日本Toyobo 公司，細胞培養(yǎng)箱購自中國香港Heal Force公司，熒光顯微鏡為美國賽默飛公司的EVOS FL Auto全自動細胞成像系統(tǒng)。

二、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)

取新生3 d 的SD 大鼠乳鼠，處死后分離膝關節(jié)軟骨，剪碎成1 mm3大小軟骨塊，加入胰酶，37 ℃消化30 min，離心后棄上清，加入Ⅱ型膠原酶37 ℃消化6 h后將細胞懸液離心棄上清，培養(yǎng)基重懸后轉移至細胞培養(yǎng)瓶，置于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

（二）CCK8實驗

胰酶消化軟骨細胞，96孔板中每孔加入約2 000個細胞，設置5 個不同濃度的FGF18 組（0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml），依次加入相應濃度FGF18 重組細胞因子，分別干預細胞48 h 和72 h。檢測時每孔更換成100 μl新鮮培養(yǎng)基并加入10 μl CCK8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min 后于450 nm波長下檢測吸光度值（OD值）。

（三）免疫熒光染色

將不同濃度的FGF18 干預軟骨細胞48 h 后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min 后加入0.1%濃度TritonX?100破膜，10 min后加入5%的牛血清白蛋白室溫封閉1 h。加入以1∶300稀釋的小鼠源acetylat?ed?α?tubulin抗體，4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 遍后加入熒光二抗，室溫孵育1 h，隨后加入4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6?diamino?2?phenylindole,DAPI），室溫下避光孵育10 min 后于熒光顯微鏡下觀察。

根據(jù)不同濃度的FGF18 干預軟骨細胞后CCK8和免疫熒光染色結果，選取最佳濃度設置為FGF18組，另外設置對照組、水合氯醛組（40 μmol/L）、水合氯醛+FGF18組，均在干預軟骨細胞48 h和72 h后進行CCK8 實驗，干預軟骨細胞48 h 后進行免疫熒光染色，實驗步驟同上。

（四）甲苯胺藍染色

將上述不同分組的藥物干預軟骨細胞72 h后棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定15 min，再加入甲苯胺藍染液室溫孵育15 min，棄染液后用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，用相機拍照觀察細胞染色情況。

（五）Live/dead實驗

在10 ml磷酸鹽緩沖液中加入20 μl 2 mmol/L的EthD?1 儲備溶液，震蕩混勻后再加入5 μl 4 mmol/L的鈣黃綠素AM 儲備液，震蕩混勻后得到濃度為2 μmol/L 鈣黃綠素AM 和4 μmol/L EthD?1 的工作液。軟骨細胞經(jīng)不同分組藥物干預48 h 后棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍后加入工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育5 min，熒光顯微鏡下拍照觀察。

（六）Western blot實驗

軟骨細胞經(jīng)不同分組的藥物干預48 h后提取總蛋白，取20 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，分別加入CyclinD1（1∶200）、COL Ⅱ（1∶1 000）、ERK（1∶1 000）、P?ERK（1∶1 000）、GAP?DH（1∶300）一抗，4 ℃孵育過夜后用三乙醇胺緩沖鹽+Tween 20 溶液（tris?buffered saline and tween 20,TBST）洗滌3遍，再在室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠二抗（1∶5 000）1 h，TBST 洗滌后用增強化學發(fā)光法（enhanced chemiliuminescent,ECL）顯色系統(tǒng)檢測。

（七）RT?PCR實驗

軟骨細胞經(jīng)不同分組藥物干預48 h后，用Trizol法提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA，在八聯(lián)管中配制20 μl 的反應體系進行RT?PCR，其中包括1 μl cDNA、1 μl 引物、10 μl SYBR?Green DNA 聚合酶和8 μl 去RNA 酶水，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

三、統(tǒng)計學分析

每組實驗至少重復3 次，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件（IBM 公司，美國），數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同濃度FGF18促進軟骨細胞增殖活性

以不同濃度的FGF18 分別干預軟骨細胞48、72 h，CCK8 細胞活性檢測結果如圖1 所示，不同濃度的FGF18 對軟骨細胞均表現(xiàn)出促增殖活性作用，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，在20 ng/ml 時促增殖活性最為明顯，與0 ng/ml 組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 不同濃度FGF18對軟骨細胞增殖活性的影響（*P＜0.05）

二、不同濃度FGF18 影響軟骨細胞初級纖毛表達水平和長度變化。

以不同濃度FGF18 干預軟骨細胞48 h 后通過熒光染色檢測初級纖毛表達水平（圖2），0 ng/ml 時初級纖毛發(fā)生率為（77.91±5.53）%，長度為（1.63±0.67）μm；FGF18 濃度為5 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（52.91±5.61）%，長度為（2.67±0.90）μm；FGF18濃度為10 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（42.12±5.20）%，長度為（2.71±0.97）μm；FGF18 濃度為20 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（36.53±4.88）%，長度為（2.76±1.37）μm；FGF18 濃度為40 ng/ml 時，初級纖毛發(fā)生率為（33.44±5.98）%，長度為（2.79±1.13）μm。與0 ng/ml組相比，各濃度組初級纖毛表達水平和長度的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

三、初級纖毛參與FGF18 對軟骨細胞增殖和表型的調控

根據(jù)前面實驗結果，選擇FGF18 組中FGF18 的濃度為20 ng/ml。如圖3 所示，F(xiàn)GF18 組干預48 h、72 h 后軟骨基質的分泌增多，有效維持軟骨細胞活性和軟骨表型。而水合氯醛組初級纖毛表達明顯下調（9.10%±2.44%），凋亡軟骨細胞比例增加（活細胞占比為72.86%±2.95%），而水合氯醛+FGF18組初級纖毛的表達水平?jīng)]有明顯變化（10.01%±2.23%），同時伴有一定比例的細胞凋亡（活細胞占比為76.94%±5.62%），相比對照組（纖毛發(fā)生率為77.91%±5.53%，活細胞占比為96.81%±1.38%）和FGF18 組（纖毛發(fā)生率為36.53%±4.88%，活細胞占比為96.29%±2.17%）均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

CCK8細胞活性實驗的結果顯示，F(xiàn)GF18組軟骨細胞的增殖活性上調，而當水合氯醛破壞纖毛結構后，不論是否再加入FGF18，軟骨細胞的增殖活性較FGF18 組均明顯受到抑制，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。此外，破壞初級纖毛結構能夠明顯抑制FGF18 對軟骨基質的促分泌作用，并且明顯下調軟骨表型相關基因COLⅡ和SOX9 的表達，結果與FGF18 組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖2 不同濃度FGF18對初級纖毛表達水平和長度變化的影響 a～e：初級纖毛的熒光染色；f：不同濃度組初級纖毛的發(fā)生率；g：不同濃度組初級纖毛的長度（*P＜0.05）

圖3 初級纖毛參與FGF18對軟骨細胞增殖和分化發(fā)育的調控 a～d：Live/dead熒光染色；e～h：初級纖毛的熒光染色；i：活細胞所占比例；j：初級纖毛的發(fā)生率；k：藥物干預48 h和72 h后細胞增殖活性；l：甲苯胺藍染色；m：藥物干預后表型相關基因COL Ⅱ的mRNA相對表達量；n：藥物干預后表型相關基因SOX9的mRNA相對表達量（C：對照，CH：水合氯醛，*P＜0.05）

四、ERK通路參與FGF18對軟骨發(fā)育的調控

如圖4所示，20 ng/ml FGF18能夠明顯促進增殖蛋白CyclinD1 和表型蛋白COLⅡ表達增加，而水合氯醛破壞初級纖毛結構后，F(xiàn)GF18 對相關蛋白的促表達作用受到抑制，與對照組和FGF18 組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與此同時，F(xiàn)GF18能維持P?ERK 的表達，并且呈上調趨勢；破壞纖毛結構后，P?ERK 的表達降低，此時再加入FGF18時，其對P?ERK 的促表達效應明顯受到抑制。與FGF18組相比，水合氯醛組中P?ERK/T?ERK 的比值均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

討 論

FGF18作為成纖維細胞生長因子家族中的重要成員，是一種具有潛力可以改善骨關節(jié)炎疾病的藥物，對調控軟骨細胞的生長發(fā)育具有非常重要的作用，同時因其具有較少的副作用，表現(xiàn)出重要的臨床應用價值，但是目前對FGF18調控軟骨發(fā)育機制的認識仍十分有限。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18 能夠作為軟骨合成代謝的促進因子。體內環(huán)境中，F(xiàn)GF18 廣泛分布于軟骨膜和關節(jié)間隙，可以作為軟骨細胞增殖的啟動因子，促進胞內物質的合成代謝［11］。FGF18能特異性結合FGFR3 活化FGF 信號通路來調控軟骨基質的合成及分泌，進而調控軟骨發(fā)育［6］。FGF18還能參與調控骨髓間充質干細胞的軟骨誘導分化，促進軟骨基質的分泌并且延緩細胞向終末期肥大軟骨細胞分化［12］。FGF18還能參與骨關節(jié)炎軟骨組織的再生修復，延緩軟骨退變。例如，F(xiàn)GF18可以通過調控PI3K?AKT信號傳導減弱白細胞介素1β（Interleukin?1β,IL?1β）誘導的細胞凋亡，同時增強線粒體融合和裂變，恢復線粒體功能并減少炎癥因子誘導的活性氧（Reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生［6］。FGF18能夠促進骨關節(jié)炎軟骨細胞Ⅱ型膠原表達并分泌更多的透明軟骨細胞基質，促進功能化的軟骨再生［11］。在關節(jié)腔內注射FGF18 能延緩創(chuàng)傷性關節(jié)炎軟骨退變，增加軟骨厚度，而FGF18 在體內的抗分解代謝效應可以通過調控金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitors of metalloproteinase?1,Timp1）的表達來發(fā)揮效應［13］。而在骨關節(jié)炎病人中，關節(jié)腔內注射FGF18 能減少軟骨厚度與體積的丟失，并且呈一定的濃度依賴性［14］。目前，F(xiàn)GF18在臨床的應用價值不斷得到重視，深入認識其軟骨保護作用機制具有重要的研究價值。

初級纖毛作為具有多樣功能的細胞器結構，被證實能夠參與調控軟骨組織發(fā)育，軟骨力學信號轉導，軟骨相關疾病和軟骨腫瘤的發(fā)生［8，10，15，16］。初級纖毛結構和功能的完整性對維持細胞內穩(wěn)態(tài)，調控軟骨生長發(fā)育至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR 能夠通過與細胞內激酶的交互作用來影響初級纖毛的長度和功能［17］。而調節(jié)FGFR3 介導的FGF 信號能夠影響初級纖毛的長度和物質轉運功能，初級纖毛是FGF通路中重要的組成部分［15］。這些研究有助于認識異常的FGF 信號和初級纖毛在軟骨發(fā)育不全和軟骨腫瘤發(fā)生過程中的作用及機制。而本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的FGF18 對體外培養(yǎng)的軟骨細胞具有明顯的促增殖活性，并且在20 ng/ml 濃度時表現(xiàn)出最顯著的促增殖效應。初級纖毛作為一種由微管結構聚合而成的細胞器，其在結構上與紡錘體同源，參與細胞的分裂周期，在功能上又具有感受外界理化刺激、轉導信號分子等多種功能，其表達水平和長度改變能反應細胞新陳代謝和功能的變化。

圖4 ERK通路參與FGF18對軟骨細胞增殖和表型的調控 a：不同組別中表型蛋白COL Ⅱ、增殖蛋白CyclinD1、通路蛋白P?ERK和T?ERK的表達情況；b：定量分析COL Ⅱ蛋白的相對表達量；c：定量分析CyclinD1蛋白的相對表達量；d：定量分析P?ERK/T?ERK 的蛋白表達比值（C：對照，CH：水合氯醛，*P＜0.05）

在本研究中，通過分析軟骨細胞初級纖毛的發(fā)生率和長度變化時發(fā)現(xiàn)，隨著FGF18 濃度的增加，初級纖毛的表達水平逐漸降低，但是其纖毛的平均長度則逐漸增加。這可能是因為FGF18 能夠通過啟動細胞進入分裂周期，促進了初級纖毛結構和紡錘體結構的轉化，初級纖毛微管解聚并且重新聚合為紡錘體樣結構，細胞進入增殖狀態(tài)，此時細胞代謝活動增加，細胞內物質轉運活躍，在紡錘體與初級纖毛周期性轉化的同時也在不斷強化初級纖毛的物質轉運功能，包括對營養(yǎng)物質和信號蛋白的轉運，從而又促進纖毛的延長以強化其物質轉運、信號轉導和理化感受器等功能［18］。而破壞初級纖毛后，F(xiàn)GF18對軟骨基質的促分泌作用受到抑制，增殖活性受到抑制，凋亡軟骨細胞增加，下調軟骨表型基因表達，同時在蛋白水平抑制FGF18 對軟骨細胞增殖和表型蛋白的促表達效應。說明破壞初級纖毛結構后，軟骨細胞內新陳代謝紊亂，微管結構破壞，無法實現(xiàn)紡錘體和初級纖毛的結構轉化，細胞增殖活性受到抑制，而初級纖毛結構的破壞使得其物質轉運功能、感受器功能和信號轉導功能均受到破壞，也直接影響了軟骨細胞對微環(huán)境變化的反應和適應能力，并且阻斷了纖毛相關信號通路的轉導，進而對軟骨細胞包括增殖、分化等多種生命活動產(chǎn)生負面調控效應［19］。因此，初級纖毛結構和功能的完整性可能影響FGF18 對軟骨細胞增殖和表型維持的調控過程，而初級纖毛在軟骨細胞內的解聚、重構以及延伸變化可能是影響FGF18 發(fā)揮生物學效應的重要調節(jié)因素，也為探究FGF18 介導的軟骨發(fā)育調控機制提供了新的思路。