靈芝多糖對糖尿病腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

鐘濤 張國新 周迪夷

[摘要] 目的 探討靈芝多糖對糖尿病腎?。―N）小鼠腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。 方法 將40只C57BL/KsJ-db/db小鼠按體重隨機(jī)分為5組，每組8只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)。模型組、靈芝多糖（GLP）低（100 mg/kg）、高（400 mg/kg）劑量組和厄貝沙坦組（50 mg/kg）給予高糖飼料喂養(yǎng)，DN小鼠造模成功后，各組每日灌胃給藥，持續(xù)8周，測定各組小鼠腎功能、血脂等生理指標(biāo)變化;取腎組織HE染色觀察GLP對小鼠腎臟病理改變的影響，用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)及mRNA水平。 結(jié)果 與模型組比較，GLP低、高劑量組血脂代謝及腎功能升高（P < 0.05）。與模型組比較，GLP低、高劑量組及厄貝沙坦組E-cadherin蛋白及mRNA水平升高，而α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白及mRNA水平降低（P < 0.01）。Smad2、Smad3總蛋白表達(dá)水平無變化。 結(jié)論 GLP可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路，抑制DN小鼠的EMT。

[關(guān)鍵詞] 靈芝多糖;上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化;糖尿病腎病;TGF-β1/Smad信號通路

[中圖分類號] R587.24? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（c）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of ganoderma lucidum polysaccha-ride （GLP） on epithelial-to-mysenchymal transition （EMT） of renal tubular epithelial cells in diabetic nephropathy （DN） mice. Methods Forty C57BL/KsJ-db/db mice were randomly divided into 5 groups by weight. Normal group was fed with normal feed. Model group， GLP low （100 mg/kg）， high （400 mg/kg） dose groups and Irbesartan group （50 mg/kg， Irbesartan） were given high-sugar dieat. Each group was given the drug by gavage daily for 8 weeks after successful modeling of DN mice. The changes of renal function， blood lipid and other physiological indexes were measured. The protein expression and mRNA level of E-cadherin， α-SMA， TGF-β1， Fibronectin， Vimentin， N-cadherin， TGF-β1， p-Smad2， p-Smad3， Smad2 and Smad3 were measured by Western Blot and Real-time PCR. Results Compared with the model group， the renal function and blood lipid metabolism in GLP low and high doses group were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the levels of E-cadherin protein and mRNA were increased in the GLP low and high doses group and the Irbesartan group， while the levels of α-SMA， Fibronectin， Vimentin， N-cadherin protein and mRNA were decreased （P < 0.01）. The expression levels of Smad2 and Smad3 were unchanged. Conclusion GLP inhibits EMT maybe via inhibition of TGF-β1/Smad signaling pathway.

[Key words] Ganoderma lucidum polysaccharide; Endothelial to mesenchymal transition; Diabetic nephropathy; TGF-β1/Smad signaling pathway

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的嚴(yán)重的微血管病變并發(fā)癥[1-2]，腎間質(zhì)纖維化是其主要病理變化之一[3]，其初始環(huán)節(jié)之一是腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial to mesenchymal transition，EMT）[4-5]，而轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是其發(fā)生的重要誘導(dǎo)因子[6]。靈芝多糖（ganoderma lucidum polysaccharide，GLP）具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)等活性[7-8]。因此，本研究通過給予DN動(dòng)物模型不同劑量的GLP，觀察GLP對DN的保護(hù)作用，從TGF-β1/Smad通路探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級2型糖尿病（T2DM）模型C57BL/KsJ-db/db雄性小鼠40只，購于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0015。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號SYXK（浙）2013-0184。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，相對濕度50%～70%。

1.2 試劑與藥品

GLP，純度>95%杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司（Johncan International），批號：GK221020。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物造模及給藥? 適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，32只小鼠給予高糖高熱量飼料，另8只小鼠，作為正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)。1周后小鼠尾靜脈采血，以空腹血糖>11.1 mmol/L，尿微量白蛋白>20 mg/L，判定DN小鼠模型造模成功。每日灌胃給藥，持續(xù)8周。分為正常組、模型組、GLP低（100 mg/kg）、高（400 mg/kg）劑量組、厄貝沙坦組（50 mg/kg），每組8只。

1.3.2 指標(biāo)測定及腎臟病理學(xué)觀察? 測定各組小鼠體重、攝食量、飲水量、尿量。腹主動(dòng)脈采血，3500 r/min（離心半徑22 cm），離心15 min，取血清，7020 full automatic biochemical analyzer（Hitachi，Japan）測定血清葡萄糖、胰島素、肌酐、尿素氮、血脂;檢測試劑盒（Jiangcheng，China），測定尿酸、尿肌酐、尿微量蛋白。提取腎臟組織，稱重，計(jì)算腎臟指數(shù)及肌酐清除率，部分用于石蠟切片，HE染色后于400×光鏡下觀察。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time）PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)? 采用Real-time PCR檢測腎臟組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、TGF-β1的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，相對表達(dá)量（2-△△Ct）值表示目的基因的表達(dá)水平。用Western blot法檢測E-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，并計(jì)算灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLP對DN小鼠代謝的影響

模型組小鼠的體重、腎臟指數(shù)、空腹血糖、攝食量、飲水量及尿量高于正常組（P < 0.01）;與模型組比較，GLP低、高劑量組及厄貝少坦組小鼠的體重、腎臟指數(shù)、空腹血糖、攝食量、飲水量及尿量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 GLP對DN小鼠腎功能的影響

模型組小鼠的肌酐清除率、尿肌酐、血肌酐、尿酸、尿微量蛋白、血清胰島素、尿素氮高于正常組（P < 0.01）;與模型組比較，GLP低、高劑量組及厄貝沙坦組肌酐清除率、尿肌酐、血肌酐、尿酸、尿微量蛋白、血清胰島素、尿素氮降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 GLP對DN小鼠血脂代謝的影響

與正常組比較，模型組小鼠總膽固醇，三酰甘油和低密度脂蛋白升高，而高密度脂蛋白降低（P < 0.01）;與模型組比較，GLP低、高劑量組及厄貝沙坦組小鼠總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白降低，而高密度脂蛋白升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表3。

2.4 GLP對DN小鼠腎小球病變的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎小球系膜基質(zhì)明顯增多，腎小球內(nèi)細(xì)胞也明顯增多;與模型組比較，GLP低、高劑量組及厄貝沙坦組小鼠腎小球系膜基質(zhì)及腎小球內(nèi)細(xì)胞均明顯減少。見圖1。

2.4 GLP對DN小鼠TGF-β1/Smad信號通路的影響

與正常組比較，模型組E-cadherin蛋白及mRNA水平降低（P < 0.01），而α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白及mRNA水平升高（P < 0.05）;與模型組比較，GLP低、高劑量組及厄貝沙坦組E-cadherin蛋白及mRNA水平升高，而α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白及mRNA水平降低（P < 0.01）。Smad2和Smad3總蛋白表達(dá)水平無變化。見圖2、表4。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病主要病理變化之一[3，11]。文獻(xiàn)常采用腎臟指數(shù)、肌酐清除率、尿肌酐等指標(biāo)反映腎功能[12]。糖尿病腎病患者的血脂代謝往往紊亂[13-15]，從而加重腎組織的損傷。本研究中，GLP干預(yù)后，腎功能指標(biāo)、血脂代謝較模型組有所改善，腎臟病理切片也顯示干預(yù)后小鼠的腎損傷得以減輕。

TGF-β1/Smad信號通路激活是DN發(fā)展的主要機(jī)制[9-10]，多方面參與腎小管EMT的發(fā)生過程[16-17]，會出現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin丟失、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的增長[18]，而下調(diào)TGF-β1/smad信號通路可以抑制該過程[19-24]。本研究中，模型組上皮細(xì)胞標(biāo)志物降低、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物升高，TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3水平降低，而GLP干預(yù)后，上述變化得以逆轉(zhuǎn)，提示GLP可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/smad信號通路抑制EMT的過程。

綜上，GLP抑制高糖刺激下腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/smad信號通路來完成的。研究結(jié)果為其用于糖尿病腎病臨床治療的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-09-02? 本文編輯：劉永巧）