四川洪壩鄉(xiāng)紅景天HPLC指紋圖譜研究

孫云波 沈碩 張創(chuàng)峰

[摘要] 目的 建立紅景天的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)，同時對不同批次紅景天的質(zhì)量進行研究。 方法 采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，以Waters Xbridge？誖 Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）為色譜柱、乙腈-0.1%冰醋酸為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為276 nm，柱溫為30℃，進樣體積為10 μL，記錄時間為70 min。 結(jié)果 HPLC指紋圖譜的方法學(xué)考察符合相關(guān)要求，共標(biāo)定紅景天藥材HPLC指紋圖譜的17個共有峰，指認(rèn)其中紅景天苷、沒食子酸、咖啡酸、酪醇、對香豆酸、原兒茶酸、兒茶酸、香草醛、異槲皮苷、槲皮苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷和山奈酚12個特征峰，13批紅景天藥材指紋圖譜的相似度在0.863～0.984。 結(jié)論 所建立的紅景天HPLC指紋圖譜可為紅景天質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 紅景天;高效液相色譜指紋圖譜;紅景天苷;相似度;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

[中圖分類號] R927.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（a）-0023-05

[Abstract] Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Herba Rhodiolae， and to provide the basis for the establishment of quality standards， and at the same time， to study the quality of different batches of Herba Rhodiolae. Methods RP-HPLC method was used. Waters Xbridge？誖 Shield RP18 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） wan used as the column， acetonitrile-water containing 0.1% acetic acid was used as the mobile phase of the gradient elute， with the detection wavelength of 276 nm and the colomn temperature maintained at 30℃. The flow rate was 1.0 mL/min. The recording time was 70 min. Results The HPLC fingerprint method validation met the technical standards. A total of 17 common peaks of Herba Rhodiolae. were found. A total of 12 characteristic peak were identified. They were salidroside， callic acid， caffeic aci， tyrosol， p-coumaric acid， protocatechuic acid， catechin， vanillin， isoquercitrin， quercitrin， chrysophanol 8-O-β-D-glucoside， kaempferol， respectively. The similarity of 13 differernt batches of Herba Rhodiolae. was among 0.863-0.984. Conclusion The specific HPLC fingerprint can be used as a method of scientific evaluation for Herba Rhodiolae. crenulata.

[Key words] Herba Rhodiolae; High performance liquid chromatography figerprint chromatograms; Salidroside; Similarity; Quality standard

紅景天為景天科大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba的干燥根和根莖[1]。其味甘、苦，性平，歸肺、心經(jīng)[2]。常用于控制高原反應(yīng)，治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和消除疲勞[3-4]。紅景天還具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和激活磷酸酰肌醇激酶/絲氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種藥理的作用[4-13];紅景天的化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要為多糖類、甾醇類、鞣酸類和黃酮等[14-16]，它們共同構(gòu)成了紅景天的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，通常以紅景天苷（含量不得少于0.50%）作為其質(zhì)量控制的唯一標(biāo)示性成分[1]。然而由于中藥材成分的復(fù)雜性，單一成分不足以全面反映紅景天的內(nèi)在質(zhì)量;指紋圖譜技術(shù)是從藥材的整體物質(zhì)基礎(chǔ)角度出發(fā)，系統(tǒng)把握藥材質(zhì)量的一種分析技術(shù)手段，為藥材質(zhì)量的有效把控提供了一種可靠的質(zhì)控方法[17-27]。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法對紅景天藥材質(zhì)量進行了研究，建立了紅景天的指紋圖譜，為公司順利通過連花清瘟膠囊美國食品和藥物管理局（FDA）二期臨床提供更可靠的原藥材質(zhì)量支持，同時為提高紅景天藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀（PDA檢測器，柱溫箱，自動進樣器;Empower Pro色譜工作站）（美國Waters）;AL204型萬分之一及AB135-S型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）;KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;色譜柱Waters Xbridge？誖 Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm） （美國Waters）;DL-5200B-Ⅱ型低速大容量多管離心機離心半徑為19.6 cm（上海安亭科學(xué)儀器廠）;Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國密理博公司）;0.45 μm微孔濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

紅景天苷（批號：1001210553，美國sigma）;沒食子酸（批號：1110831-201605，中國食品藥品檢定研究院）;酪醇（批號：111676-200602，中國藥品生物制品檢定所）;咖啡酸（批號：1001098874，美國sigma）;對香豆酸（批號：112037-201801，中國食品藥品檢定研究院）;原兒茶酸（批號：809-200102，中國藥品生物制品檢定所）;兒茶酸（批號：13051511，成都生物化工有限公司）;香草醛（批號：20180712，天津市光復(fù)精細化工研究所）;異槲皮苷（批號：111809-201403，中國食品藥品檢定研究院）;槲皮苷（批號：111538-200504，中國藥品生物制品檢定所）;大黃酚-8-O-葡萄糖苷（批號：B20239，上海源葉生物科技有限公司）;山奈酚（批號：1354900，USP 12601 Twinbrook Pkwy，Rockville， MD.）;甲醇（色譜純，美國Fisher）;乙腈（色譜純，美國Fisher），其余試劑均為分析純，水為超純水。

紅景天藥材經(jīng)石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司中藥資源部崔旭盛高級工程師鑒定為大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H. Ohba。藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Xbridge？誖Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動相為乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）;梯度洗脫見表2;柱溫：30℃;檢測波長為276? nm;進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

稱定紅景天粉末（過三號篩）約1 g，精密加入75%甲醇20 mL于50 mL具塞錐形瓶中，稱定重量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）15 min，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，3500 r/min離心5 min，取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱定各對照品適量，置具塞容量瓶中，加75%甲醇溶解，超聲5 min并制成每1 mL 75%甲醇中含紅景天苷、酪醇、兒茶素、大黃酚-8-O-葡萄糖苷對照品約0.50 mg，香草醛、對香豆酸、異槲皮苷、槲皮苷、山奈酚對照品約1.00 mg，沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸約1.50 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗? 取供試品溶液R8，連續(xù)進樣6次，各色譜峰的相對（2號紅景天苷）保留時間的RSD均<0.26%，相對峰面積的RSD均<4.35%，所得的色譜圖的相似度分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998，RSD為0.06%，儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗? 取供試品溶液R8，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，各共有有色譜峰的相對（2號紅景天苷）保留時間的RSD均<0.34%，相對峰面積的RSD均<5.55%，所得的色譜圖的16個共有峰的相似度分別為0.997、0.999、0.999、0.999、0.995、0.996、1.000、 0.997，RSD為0.18%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗? 取樣品R8，平行制備6份供試品溶液，測定，各共有色譜峰的相對（2號紅景天苷）保留時間的RSD均<0.34%，相對面積的RSD均<2.17%，所得的色譜圖的相似度分別為0.999、0.999、0.999、 1.000、1.000、0.998，RSD為0.08%，本方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

13個不同批次的紅景天HPLC檢測結(jié)果顯示，共有近30個共有峰，見圖1。選取分離度較好、響應(yīng)值較高的共有峰中17個色譜峰作為評價紅景天藥材質(zhì)量的共有峰。

1：沒食子酸;2：紅景天苷;3：原兒茶酸;4：酪醇;5：兒茶素;6：咖啡酸;7：香草醛;10：對香豆酸;11：異槲皮苷;15：槲皮苷;16：大黃酚-8-O-葡萄糖苷;17：山奈酚

確定17個共有峰后，將對照品溶液色譜峰的保留時間與供試品溶液色譜峰的保留時間及紫外吸收光譜圖進行比對（圖1）。被鑒定的供試品溶液中12個色譜峰的紫外圖譜（圖2），其中以峰面積較大，出峰穩(wěn)定的2號色譜峰紅景天苷為參照峰，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012. 130723版）進行相似度評價并建立共有模式，生成不同批次紅景天藥材樣品疊加圖譜及對照圖譜（圖3），將生成的對照圖譜（R）的相似度值定為1，計算各批紅景天藥材樣品指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示其相似度為0.863～0.984。見表3。

2.6 指紋圖譜分析

由匹配結(jié)果可知，13批紅景天藥材相似度較好，指紋圖譜含有17個共有峰，以2號紅景天苷為參照峰（S），計算各共有峰與S峰的相對保留時間，17個共有峰相對保留時間平均值見表4。將相對保留時間的平均值作為規(guī)定值，13批紅景天指紋圖譜17個共有峰相對保留時間均在規(guī)定值±5%范圍內(nèi)。

3 討論

本研究采用二極管陣列（PDA）檢測器在全波長范圍內(nèi)進行樣品分析，其中276 nm下檢測的色譜圖中色譜峰最多，峰值較大，且基線也較為平穩(wěn)。因此確定檢測波長為276 nm。

考察了3個品牌的5種不同的色譜柱，考慮到各色譜峰峰形、分離度及色譜柱應(yīng)用的廣泛性，本研究選擇Waters Xbridge？誖Shield RP18色譜柱。同時比較了不同流動相及色譜柱柱溫對所得的指紋圖譜色譜圖的影響，結(jié)果顯示，在柱溫30℃時，以乙腈-0.1%冰醋酸為流動相進行梯度洗脫，色譜圖中的色譜峰信息容量較大且分離效果最好。將此分離方法的時間延長至2倍（140 min），結(jié)果顯示，70 min后無其他色譜峰出現(xiàn)，從而確定梯度洗脫時間為70 min。

在提取工藝優(yōu)化過程中，以不同比例分?jǐn)?shù)的甲醇和乙醇作為溶媒，分別對提取方式和時間進行了考察。結(jié)果顯示，75%甲醇超聲15 min得到的色譜峰信息最佳。因此，采用該方法進行樣品的提取。

本研究采用HPLC-PDA法梯度洗脫建立了紅景天指紋圖譜，同時對色譜條件和供試品溶液的制備方法進行了優(yōu)化，并進行了方法學(xué)考察;其相對保留時間-精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD均<0.4%。且建立了紅景天藥材指紋圖譜共有模式，為公司順利通過連花清瘟膠囊FDA二期臨床提供更可靠的原藥材質(zhì)量支持，同時為提高紅景天藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-08-19? 本文編輯：劉永巧）