超聲處理的大豆分離蛋白/麥芽糊精混合物酸誘導凝膠性質(zhì)研究

趙城彬 尹歡歡 鄢健楠 曹 勇 張 浩 許秀穎 吳玉柱 劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 小麥和玉米深加工國家工程實驗室 長春130118）

蛋白質(zhì)凝膠是溶液中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性后暴露出活性基團，通過蛋白質(zhì)之間及相鄰肽鏈之間的相互作用和蛋白質(zhì)與水之間的相互作用，使分子有規(guī)律的聚集、交聯(lián)，分子間與分子內(nèi)的作用力達到平衡，形成占據(jù)原來液體空間的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[1]。對于大豆蛋白而言，凝膠性尤為重要，利用該特性可使傳統(tǒng)的豆腐和豆腐腦等食品的質(zhì)構(gòu)及感官得到顯著的改善，有利于增加肉制品的嫩度、風味及切片性。蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用能夠形成混合凝膠，蛋白質(zhì)和多糖的分子結(jié)構(gòu)、理化特性和加工條件等因素會影響混合凝膠體系的流變特性、微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性，蛋白質(zhì)與多糖之間發(fā)生的相互作用在一定程度上會改善蛋白質(zhì)的功能特性及加工特性[2]。Zhang 等[3]發(fā)現(xiàn)在中性條件下，共同加熱果膠和乳清蛋白形成的絡合物能夠形成更加堅固的凝膠，與乳清蛋白溶液相比，果膠/乳清蛋白絡合物具有更為光滑的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。閔維等[4]對大豆分離蛋白/葡聚糖冷致凝膠性質(zhì)進行研究，隨著葡聚糖濃度的增加，混合凝膠的黏彈性呈先上升后下降的趨勢；而混合凝膠的黏彈性隨著葡聚糖分子質(zhì)量的增加變化更加顯著。超聲波是指頻率超過人類聽覺范圍的聲波，是一種彈性振蕩波[5]。將超聲波直接作用于蛋白分子，通過對蛋白分子結(jié)構(gòu)的修飾，進而改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、凝膠性等功能特性[6]。此外，超聲作用還可能促進大分子物質(zhì)之間的相互作用，例如蛋白質(zhì)與多糖之間的互溶或相分離，這對蛋白質(zhì)的功能特性具有重要影響。目前，關(guān)于超聲處理下大豆分離蛋白（SPI）/麥芽糊精（MD）混合物酸誘導凝膠性質(zhì)的研究鮮有報道。本試驗對SPI 與MD 混合溶液進行超聲處理，測定酸誘導凝膠流變性、微觀結(jié)構(gòu)、凝膠強度及持水性，探討超聲處理對SPI/MD 混合物酸誘導凝膠性質(zhì)的影響，為改善大豆蛋白凝膠特性及開發(fā)凝膠型大豆制品奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（SPI），哈高科食品有限責任公司；麥芽糊精（MD），美國Sigma 公司；葡萄糖酸內(nèi)酯（GDL），北京沃海環(huán)球科技有限公司；無水乙醇，南京化學試劑廠；其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

JY92-2D 超聲探頭發(fā)生器，寧波Scientz 生物科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；GL-21M 高速冷凍離心機，上海市離心機械研究所；Bohlin 旋轉(zhuǎn)流變儀，英國馬爾文儀器有限公司；S-3400N 型掃描電鏡，日本日立公司；TA-XT2 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Microsystems 公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲處理下SPI/MD 混合凝膠的制備 將SPI 分散到磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）中，配制成質(zhì)量分數(shù)為6%的SPI 溶液。將SPI 溶液室溫下磁力攪拌2 h，95 ℃水浴中熱處理30 min，冷卻至室溫后添加質(zhì)量分數(shù)為2%的MD，混合均勻即得SPI/MD 混合液。在超聲功率為200 W 下，分別對蛋白/多糖混合液進行超聲處理0，5，15，25 min，超聲處理模式為開啟3 s，關(guān)閉2 s，同時采用冰水浴控制溫度為25～30 ℃。向超聲處理后的混合液中添加質(zhì)量分數(shù)為0.6%的GDL，充分混勻后25 ℃下酸化5 h，酸化結(jié)束后4 ℃冷藏過夜，即得酸誘導凝膠。未經(jīng)超聲處理且不含MD 的SPI 凝膠為對照組。

1.3.2 凝膠流變性測定 根據(jù)Zhao 等[7]的方法測定凝膠樣品的流變性。將樣品溶液加入GDL 后置于流變儀平板之間，平板距離1 mm，平板間充滿溶液后擦去多余的溶液，滴2～3 滴植物油于溶液裸露部位以防止水分蒸發(fā)，然后加上保溫套準備測定。設定應變?yōu)?.5%，頻率為1 Hz，25 ℃下酸化5 h，進行時間掃描，記錄整個酸化過程中樣品的儲能模量（G′）及損耗模量（G″）隨時間的變化。初始應變掃描試驗顯示流變性的測定在線性粘彈區(qū)域內(nèi)。時間掃描結(jié)束后分別對樣品進行0.01～10 Hz 范圍內(nèi)的頻率掃描和0.0001～1 范圍內(nèi)的振幅掃描，記錄G′及G″隨頻率和應變的變化。

1.3.3 凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察 根據(jù)Chin 等[8]的測定方法，取一定量的凝膠樣品，加入戊二醛溶液固定后冷凍，用磷酸緩沖液沖洗，然后分別用30%，50%，70%，90%，100%的乙醇進行脫水10 min，按100%乙醇∶叔丁醇=1∶1 脫水10 min，純叔丁醇脫水10 min，然后凍干。將凍干凝膠樣品進行離子濺射噴金鍍膜后置于掃描電鏡觀察臺上進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。電鏡加速電壓為5 kV，放大倍數(shù)為2 000倍。

1.3.4 凝膠強度測定 采用TA-XT2 質(zhì)構(gòu)儀對凝膠強度進行測定[9]。將凝膠樣品放于測量臺上，采用P/0.5 的探頭進行測定，模式選擇TPA 模式，設置壓縮前、壓縮中、壓縮后的速度分別為3.0，2.0，3.0 mm/s，凝膠壓縮比例為35%，兩次下壓間隔5 s，觸發(fā)力為5 g。測定后得質(zhì)構(gòu)參數(shù)，凝膠強度以探頭下壓過程中的最大感應力表示。

1.3.5 凝膠持水性測定 采用Zhao 等[10]的離心法測定凝膠持水性。將空離心管進行稱重后放入適當質(zhì)量的凝膠樣品，在3 000×g 下離心15 min，離心結(jié)束后將離心管取出，室溫下靜置10 min，將上清液吸出后稱重，凝膠持水性計算公式如下：

持水性（%）=（M2-M0）/（M1-M0）×100%

式中：M0——空離心管的質(zhì)量，g；M1——離心前裝有凝膠的離心管質(zhì)量，g；M2——吸出水分后離心管質(zhì)量，g。

1.3.6 統(tǒng)計分析 每組試驗重復3 次，采用SPSS V17.0 軟件進行ANOVA 差異顯著性分析，作圖采用Origin8.5 軟件完成，P＜0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠流變性分析

不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸化過程中G′和G″的變化如圖1所示。SPI/MD 混合物G′和G″的變化趨勢與SPI 非常相似。酸化開始時，所有體系的G′＜G″，更趨向于流體的特性，且G′和G″的變化不明顯；隨著酸化時間的延長，G′和G″逐漸增加，且G′增加速率大于G″；當達到凝膠點即G′=G″后，G′和G″急劇增加，且G′＞G″；當G′和G″達到一定數(shù)值時，增加速率變得緩慢，最終達到一個平衡值，這表明一個穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)的形成[11]。然而，與SPI（圖1a）相比，SPI/MD 混合物（圖1b～圖1e）的初始平衡時間較短，其G′和G″增加的較早，這使SPI/MD 混合物比SPI 更早到達凝膠點，縮短了凝膠形成時間，這也可從表1中凝膠時間的減少得到驗證。對于SPI/MD 混合物來說，只有超聲處理5 min 的混合物凝膠時間顯著縮短（P＜0.05），而超聲處理15 min 和25 min 的混合物凝膠時間與非超聲處理的混合物凝膠相比沒有顯著不同（P＞0.05），這說明適當?shù)某曁幚頃s短SPI/MD混合物凝膠的形成時間，利于凝膠性質(zhì)的改善。

圖1 不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸化過程中G′和G″的變化Fig.1 Changes in G′ and G″ of SPI/MD mixtures with different ultrasound time during acidification

超聲時間對SPI/MD 混合物酸化后G′和G″的影響見圖2。由圖2可以看出，酸化后所有體系的G′值遠大于G″值，這表明所有體系都形成了具有一定強度的凝膠。與SPI 凝膠相比，SPI/MD 混合物凝膠的G′值顯著增加（P＜0.05），且凝膠時間縮短（表1），這說明在SPI 中混入MD 會強化凝膠網(wǎng)絡，同時能夠使蛋白質(zhì)更快的形成凝膠，這可能與兩種大分子之間的相分離作用有關(guān)[12]。蛋白質(zhì)和多糖的相分離會使蛋白質(zhì)在一定區(qū)域內(nèi)的有效濃度增加，促進蛋白凝聚物的交聯(lián)形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，導致凝膠作用的增強[13]。此外，蛋白質(zhì)形成的連續(xù)相可以容納多糖鏈，多糖的填充作用也是導致凝膠網(wǎng)絡強化的一個原因[14]。

圖2 超聲時間對SPI/MD 混合物酸化后G′和G″的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on G′ and G″of SPI/MD mixtures after acidification

表1 不同超聲時間下SPI/MD 混合物的凝膠時間（tgel）Table1 Gelation time （tgel）of SPI/MD mixtures with different ultrasound time

超聲處理對SPI/MD 混合物凝膠的G′值具有顯著影響，與未經(jīng)超聲處理的混合物凝膠相比，只有超聲處理5 min 的混合物凝膠G′值顯著增加（P＜0.05），且凝膠時間顯著縮短（表1），而超聲處理15 min 和25 min 又會使混合物凝膠G′值顯著降低（P＜0.05），但均高于SPI 凝膠。這表明隨著超聲時間的延長，SPI/MD 混合物凝膠的G′值呈先增加后降低的趨勢，適當?shù)某曁幚砟軌蛟鰪奡PI/MD 混合物凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，而過度的超聲作用不利于凝膠網(wǎng)絡的建立。Farahnaky 等[15]對超聲處理卡拉膠冷致凝膠的機械力學特性進行研究，結(jié)果表明隨著超聲時間的延長，卡拉膠凝膠的機械強度呈先增加后降低的趨勢，這與本文的研究結(jié)果相似。

超聲引起的空化作用和物理剪切作用同時對蛋白質(zhì)和多糖產(chǎn)生影響，這直接表現(xiàn)為對分子的降解。由于多糖分子呈線性的鏈狀結(jié)構(gòu)，更易被超聲作用降解；而球狀結(jié)構(gòu)的蛋白分子具有粒子性，這會降低被超聲作用破壞的可能[16]。適當?shù)某曁幚韺嶙冃源蠖沟鞍追肿咏Y(jié)構(gòu)影響較小，不會破壞蛋白連續(xù)相，主要對多糖起到降解作用，使多糖分子質(zhì)量下降，減少多糖分子的空間占有體積，改善蛋白質(zhì)和多糖之間的熱力學不相容性，促進分子間的相互作用，導致蛋白質(zhì)/多糖混合物形成更牢固的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，宏觀上表現(xiàn)為凝膠強度的增加和凝膠時間的縮短。而過度的超聲作用會降解熱變性大豆蛋白分子，破壞蛋白連續(xù)相，削弱蛋白質(zhì)的凝膠性，同時多糖分子被破壞得更加嚴重，不利于維持高強度的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，導致凝膠網(wǎng)絡的弱化[17]。

為了進一步檢驗超聲處理后SPI/MD 混合物凝膠網(wǎng)絡的形成情況，動態(tài)掃描后進行頻率掃描。不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠的頻率掃描如圖3所示。所有體系的G′值始終大于G″值，且G′和G″的曲線彼此平行，表示GDL 酸化后均已形成了彈性凝膠。根據(jù)Winter 等[18]的研究，這是形成典型凝膠結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)。在全頻率掃描范圍內(nèi)，所有體系的G′和G″隨著頻率的增加呈微弱的上升趨勢，即G′和G″對振蕩頻率顯示出較低的依賴性，這說明所有體系形成的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此外，SPI/MD 混合物凝膠G'的變化趨勢與SPI 凝膠相似，超聲作用會使SPI/MD 混合物凝膠的G′值先增大后降低，凝膠網(wǎng)絡的強弱順序依次為：超聲5 min 混合物凝膠＞非超聲混合物凝膠＞超聲15 min 混合物凝膠＞超聲25 min 混合物凝膠＞SPI 凝膠，這與動態(tài)流變性所得到的結(jié)果一致，進一步證實了適當?shù)某曁幚砟軌驈娀疭PI/MD 混合物酸誘導凝膠。

不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠的振幅掃描如圖4所示。與SPI 凝膠相比，在整個振幅掃描區(qū)域范圍內(nèi)，SPI/MD 混合物凝膠的G′和G″相對不變的區(qū)域增加，即線性粘彈區(qū)域增加，這表明在MD 混入SPI 中能夠提高混合物凝膠的抗破壞能力，使凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)保持相對完整性。隨著超聲時間的延長，SPI/MD 混合物凝膠的線性粘彈區(qū)域先增加后減少，且超聲處理5 min 的SPI/MD混合物凝膠的線性粘彈區(qū)域最大，這一結(jié)果與動態(tài)流變性和頻率掃描的結(jié)果一致，這表明適當?shù)某曁幚頃M一步提高SPI/MD 混合物凝膠的抗破壞能力。此外，所有體系的線性粘彈區(qū)域均大于1%，而試驗采用0.5%的應變值，這表明應變值均在凝膠形成的線性粘彈范圍內(nèi)，整個測試過程均在非破壞性的小振幅條件下進行。

2.2 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

圖3 不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠的頻率掃描Fig.3 Frequency sweep for acid induced gels of SPI/MD mixture with different ultrasound time

圖4 不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠的振幅掃描Fig.4 Amplitude sweep for acid induced gels of SPI/MD mixture with different ultrasound time

圖5 不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs for acid induced gels of SPI/MD mixture with different ultrasound time

采用掃描電鏡放大2 000 倍對凝膠樣品進行觀察，不同超聲時間下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠的掃描電鏡見圖5。由圖5可以看出，SPI 酸誘導凝膠呈多孔的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，有不規(guī)則的孔洞，且空間結(jié)構(gòu)不均一（圖5a）。而SPI/MD 混合物形成的酸誘導凝膠空間結(jié)構(gòu)更加致密、均一，孔洞明顯變小，蛋白質(zhì)間的交聯(lián)度明顯增大（圖5b），說明向SPI 中混入MD 能夠強化蛋白質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu)。Monteiro 等[19]研究發(fā)現(xiàn)在乳清蛋白中混入半乳甘露聚糖會使混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)變得更加致密，這會導致凝膠強度和持水性的增加，這與本研究的結(jié)果一致。未經(jīng)超聲處理的SPI/MD 混合物凝膠呈鏈狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，它是由有序的分子排列構(gòu)成的。而超聲處理后SPI/MD 混合物凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得粗糙，呈顆粒狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，它是由無序排列的具有三維結(jié)構(gòu)的聚集體組成的，這可能是由于超聲作用使蛋白質(zhì)分子聚集導致的[20]。隨著超聲時間的延長，這種顆粒狀結(jié)構(gòu)更明顯。Stading 等[21]研究表明，鏈狀凝膠比顆粒狀凝膠更均一，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更完整，對水分子的固定作用更好，凝膠持水性更高，這與后面凝膠持水性的研究結(jié)果一致。

此外，與SPI/MD 混合物凝膠相比，只有超聲5 min 后的SPI/MD 混合物凝膠（圖5c）的交聯(lián)度稍有增加，且凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)完整性較好，而超聲15 min（圖5d）和25 min（圖5e）后的SPI/MD 混合物凝膠微觀結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)較大的裂痕，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的完整性嚴重被破壞，這些都會影響凝膠強度和凝膠持水性。凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析與本文中凝膠流變性的研究結(jié)果一致，再次印證了適當?shù)某曁幚砟軌驈娀疭PI/MD 混合物酸誘導凝膠，而過度的超聲處理會導致SPI/MD 混合物凝膠網(wǎng)絡的弱化。

2.3 凝膠強度和持水性分析

超聲時間對SPI/MD 混合物凝膠強度和持水性的影響如圖6所示。與SPI 凝膠相比，所有SPI/MD 混合物凝膠強度均增加，說明在SPI 中混入MD 能夠增加蛋白質(zhì)的凝膠強度。Pan 等[22]在大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合凝膠機械性能的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和多糖混合體系由于相分離作用而導致凝膠強度增加，這與本文的研究結(jié)果一致。超聲處理5 min 能使SPI/MD 混合物凝膠強度進一步增加，而超聲處理15 min 和25 min 則會降低混合物的凝膠強度，這表明適當?shù)某曁幚砜梢蕴岣逽PI/MD 混合物的凝膠強度，而過度的超聲作用會破壞混合物的凝膠網(wǎng)絡，這與流變性的研究結(jié)果相似。分析原因可能是由于適當?shù)某曁幚頃龠M蛋白質(zhì)和多糖的互溶，使多糖能夠更好地填充到SPI 凝膠網(wǎng)絡中，進而增強了凝膠強度；而過度的超聲作用會打斷蛋白質(zhì)連續(xù)相，嚴重降解多糖分子，從而破壞蛋白質(zhì)/多糖凝膠網(wǎng)絡，導致凝膠強度降低[23]。這也與本文中流變性的分析結(jié)果一致。

對于凝膠持水性來說，在SPI 中混入MD 能夠增加凝膠持水性。然而，超聲處理會降低SPI/MD 混合物凝膠的持水性，這可能與凝膠微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。?ak?r 等[24]對WPI/卡拉膠混合凝膠持水性的研究中發(fā)現(xiàn)，WPI/卡拉膠混合凝膠持水性的變化與凝膠微觀結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，當凝膠微觀結(jié)構(gòu)由鏈狀變?yōu)轭w粒狀會導致持水性的降低。由凝膠微觀結(jié)構(gòu)（圖5）可以看出，未經(jīng)超聲處理的SPI/MD混合物凝膠呈均勻、致密的鏈狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，孔隙度低，凝膠持水能力強；而經(jīng)超聲處理的SPI/MD 混合物凝膠呈粗糙的顆粒狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，且凝膠微觀結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)較大的裂痕，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，導致凝膠持水能力減弱。此外，Kao 等[25]對硫酸鈣豆腐的研究中發(fā)現(xiàn)具有均一、致密網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的豆腐具有更高的持水性，這也與本研究的結(jié)果一致，再次證明凝膠微觀結(jié)構(gòu)對持水性具有重要影響。

圖6 超聲時間對SPI/MD 混合物凝膠強度和持水性的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on gel strength and WHC of SPI/MD mixtures

3 結(jié)論

對超聲條件下SPI/MD 混合物酸誘導凝膠性質(zhì)進行研究。在SPI 中混入MD 由于相分離作用會促進蛋白凝聚物的交聯(lián)形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，導致凝膠網(wǎng)絡的強化和凝膠時間的縮短。超聲處理5 min 能夠進一步增強SPI/MD 混合物凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和抗破壞能力，同時加快凝膠的形成速度。而超聲處理15 min 和25 min 不利于混合物凝膠網(wǎng)絡的建立，且會使混合物的凝膠強度降低。凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析表明SPI 與MD 混合能夠使酸誘導凝膠空間結(jié)構(gòu)更加致密、均一，孔洞變小，蛋白質(zhì)間的交聯(lián)度增大。超聲處理會使SPI/MD 混合物凝膠由鏈狀結(jié)構(gòu)向顆粒狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，且隨著超聲時間的延長，這種顆粒狀結(jié)構(gòu)更明顯。超聲處理5 min 能夠使SPI/MD 混合物凝膠的交聯(lián)度增加，且凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)完整性較好；而超聲15 min 和25 min 的混合物凝膠微觀結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)較大的裂痕，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，導致凝膠強度和持水性降低。