耐鹽酵母菌對(duì)鱈魚骨酶解液風(fēng)味的改善作用

朱文慧 胡顯杰 步 營(yíng)* 李學(xué)鵬 徐永霞 沈 琳 牟偉麗 勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心” 遼寧錦州121013 2 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116000 3 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東蓬萊265600）

鱈魚（Pollock）俗稱明太魚，是全世界年捕撈量最大的魚類之一。鱈魚在加工生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，其中魚骨占鱈魚整體質(zhì)量的15%[1-2]。我國(guó)水產(chǎn)品加工率不到30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家（＞80%），對(duì)下腳料的利用更少，多數(shù)企業(yè)將其作為固體廢棄物處理，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[3]。水產(chǎn)品普遍存在腥味等不良風(fēng)味，水產(chǎn)酶解液通常亦具有苦腥味，苦腥味的存在已成為水產(chǎn)酶解液在食品行業(yè)應(yīng)用的主要限制因素[4]。目前，酵母發(fā)酵法常被用于水產(chǎn)品的脫腥、脫苦。付湘晉等[5]發(fā)現(xiàn)酵母發(fā)酵脫腥的機(jī)理之一是把醛類、醇類轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸。耐鹽酵母常被用于改善醬油的風(fēng)味物質(zhì)，在水產(chǎn)脫腥、脫苦方面還未見(jiàn)報(bào)道。

針對(duì)水產(chǎn)酶解液中存在的苦腥味問(wèn)題，本文以鱈魚骨酶解液為對(duì)象，利用耐鹽酵母對(duì)其進(jìn)行脫腥苦的研究，旨在創(chuàng)新和豐富水產(chǎn)調(diào)味料的基礎(chǔ)理論，為魚骨酶解液后續(xù)的加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚骨，大連天寶綠色食品股份有限公司；食鹽、葡萄糖均為食品級(jí)，購(gòu)于錦州市萬(wàn)維超市；AP-2002 堿性蛋白酶、FF104 中性蛋白酶、耐鹽酵母為魯氏結(jié)合酵母 （Zygosaccharomyces rouxii，Z.rouxii），安琪酵母股份有限公司；甲醛，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 設(shè)備與儀器

LY-380D 隆粵商用多功能破壁料理機(jī)，中山市隆粵電器廠；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；Biofugestratos 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；DL-1 萬(wàn)用電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PEN 3 便攜式電子鼻 （傳感器陣列由10 個(gè)金屬氧化物傳感器組成），德國(guó)Airsense 公司；Orion Star 系列手持式便攜pH 計(jì)，Thermo 公 司；Agilent 7890N-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；固相微萃取裝置、固相微萃取手柄、20 mL 頂空樣品瓶，美國(guó)SUPELCO；全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 鱈魚骨酶解液的制備

將魚骨化凍，清洗，以料液比1 ∶1 的添加量，放入破碎機(jī)，打碎。置于85 ℃水浴鍋中滅菌10 min 冷卻。后加入魚骨質(zhì)量0.3%的堿性蛋白酶和0.1%的風(fēng)味蛋白酶，在55 ℃條件下，攪拌酶解3 h后置于95 ℃的水浴鍋中滅酶15 min。過(guò)濾離心，取上清液，冷藏待用。

1.4 耐鹽酵母發(fā)酵脫苦腥條件的確定

分別按酶解液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.1%和2%添加耐鹽酵母和葡萄糖。酵母在加入酶解液前，需先用酶解液質(zhì)量10%，35～40 ℃的水活化5～10 min。

1.4.1 單因素試驗(yàn) 取一定量的魚骨酶解液，選取時(shí)間、溫度、加鹽量這3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定電子鼻，并進(jìn)行感官評(píng)定。

1.4.1.1 發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn) 添加酶解液質(zhì)量10%的食用鹽。在35 ℃下分別發(fā)酵6，12，18，24 h，以未添加酵母的酶解液作對(duì)照。

1.4.1.2 發(fā)酵溫度單因素試驗(yàn) 添加酶解液質(zhì)量10%的食用鹽。分別在30，35，40，45 ℃下發(fā)酵12 h，以未添加酵母的酶解液作對(duì)照。

1.4.1.3 加鹽量單因素試驗(yàn) 分別添加酶解液質(zhì)量5%，10%，15%，20%的食用鹽。在40 ℃下發(fā)酵12 h，以未添加酵母的酶解液作對(duì)照。

1.4.2 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，通過(guò)氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定，選擇最優(yōu)水平組合。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 氨基酸態(tài)氮、總酸和氨基酸的測(cè)定 采用甲醛滴定法，參考王琳等[6]的方法進(jìn)行氨基酸態(tài)氮的測(cè)定；參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿中和滴定法[7]進(jìn)行總酸的測(cè)定；采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸的測(cè)定。

1.5.2 電子鼻分析 根據(jù)樣品頂空揮發(fā)物通過(guò)傳感器的電阻值G 與基準(zhǔn)氣體通過(guò)傳感器的電阻值G0的比值而進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和模式識(shí)別[8]。傳感器由10 種金屬氧化物半導(dǎo)體型（Metal oxide semiconductor，MOS）化學(xué)傳感元件組成，每型傳感元件對(duì)應(yīng)的主要敏感物質(zhì)見(jiàn)表2。

表2 化學(xué)傳感器及其對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)類型Table 2 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

用50 mL 的燒杯，稱量5 g 左右的待測(cè)樣品，并用保鮮膜封口。25 ℃環(huán)境中運(yùn)用電子鼻傳感器對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)間120 s，進(jìn)樣流量和內(nèi)部流量均為300 mL/min，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為90 s 和95 s[9]。

1.5.3 感官評(píng)定 發(fā)酵脫腥液的風(fēng)味能綜合反映產(chǎn)品的感官質(zhì)量，絕大多數(shù)消費(fèi)者認(rèn)為發(fā)酵脫腥液的腥味、苦味、澀味、咸味決定著香氣和滋味，因此本試驗(yàn)選擇這4 個(gè)指標(biāo)作為評(píng)定對(duì)象，采用5級(jí)標(biāo)度法和發(fā)酵脫腥液的質(zhì)量等級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) （表3）進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。參加品評(píng)的人員由20 位食品專業(yè)品評(píng)師組成，按照標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)發(fā)酵脫腥液的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行等級(jí)評(píng)定并打分，記錄評(píng)定結(jié)果[10-13]。

表3 酶解液感官質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Evaluation criteria of sensory quality of enzymatic hydrolysate

1.5.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件 參考文獻(xiàn)[3，14-17]并適當(dāng)改進(jìn)如下：量取5 mL 待測(cè)液，裝入固相微萃取小瓶，加入轉(zhuǎn)子，密封，45 ℃水浴平衡10 min，然后將固相微萃取針頭插入小瓶中，推動(dòng)手柄使纖維頭處于頂空狀態(tài)，吸附30 min，進(jìn)樣。

色譜條件：Agilent 7890N 氣相色譜儀，HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；不分流模式進(jìn)樣；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 的速率上升至120 ℃再以升溫速率5 ℃/min 上升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊（EI 源），電子能量70 eV；色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～550（m/z）。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析 使用軟件SPSS 19.0 進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，Origin 9.1 作圖；電子鼻數(shù)據(jù)處理：每個(gè)處理進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果利用電子鼻自帶軟件對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）；GC-MS 數(shù)據(jù)處理：樣品中的揮發(fā)性成分經(jīng)氣相色譜分離，用質(zhì)譜進(jìn)行分析鑒定。分析結(jié)果利用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（Nist/Wiley）進(jìn)行初步檢索及定性分析。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脫腥苦效果的影響

不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵脫腥液PCA 分析和感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1可知，不同發(fā)酵時(shí)間下樣品第1 主成分 （PC1）的貢獻(xiàn)率為82.06%，第2 主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為15.30%，總貢獻(xiàn)率為97.36%，大于95%，說(shuō)明所受干擾很小。由圖可知，12 h 的發(fā)酵脫腥液第一主成分貢獻(xiàn)率與酶解液相比，變化最大。12 h 和24 h 在第1 主成分軸上分布較為靠近，18 h 和24 h 在第二主成分上分布較為集中。12，18 和24 h 的3 組樣品在PCA 圖上較為集中。各組數(shù)據(jù)區(qū)域間沒(méi)有重疊，說(shuō)明不同發(fā)酵時(shí)間酶解液的風(fēng)味成分可以通過(guò)PCA很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)[18]。由圖2可以看出，發(fā)酵12 h 的發(fā)酵脫腥液苦澀味輕，且具有海鮮的香味，與其它4 組相比更受歡迎，因此整體分值較高。綜合電子鼻和感官評(píng)價(jià)結(jié)果，最適脫腥時(shí)間為12 h。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間酶解液的PCA 圖Fig.1 PCA diagram of enzymatic hydrolysate at different fermentation time

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間酶解液的感官評(píng)價(jià)Fig.2 The sensory evaluation of enzymatic hydrolysate at different fermentation time

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)脫腥苦效果的影響

不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵脫腥液的PCA 和感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖3和圖4。由圖3可知，不同發(fā)酵溫度下樣品PC1 的貢獻(xiàn)率達(dá)到98.67%，PC2 的貢獻(xiàn)率為0.98%，總貢獻(xiàn)率為99.65%，大于95%，說(shuō)明所受干擾很小。酶解液和發(fā)酵脫腥液相比，PC1 變化很大。而不同發(fā)酵溫度的發(fā)酵脫腥液PC1 變化不明顯。酶解液與30，40 ℃發(fā)酵脫腥液PC2 變化差異不明顯，45 ℃和35 ℃的發(fā)酵脫腥液與其它樣品之間風(fēng)味變化差異明顯。發(fā)酵脫腥液的香氣成分與酶解液相比有明顯變化，說(shuō)明耐鹽酵母發(fā)酵可以很明顯的改善酶解液的風(fēng)味[18]。由圖4可以看出，30 ℃發(fā)酵脫腥液有較明顯的苦澀腥味；35 ℃發(fā)酵脫腥液苦澀味很淡，但腥味比較明顯；45 ℃發(fā)酵脫腥液較30 ℃和35 ℃口感好，但與40 ℃相比，還有苦澀腥味；40 ℃發(fā)酵脫腥液效果最佳、分值最高，最受歡迎，因此選擇40 ℃為最適脫腥溫度。

2.3 加鹽量對(duì)脫腥苦效果的影響

不同加鹽量發(fā)酵脫腥液的PCA 和感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5可知，不同加鹽量樣品PC1 的貢獻(xiàn)率達(dá)到86.35%，PC2 的貢獻(xiàn)率為9.94%，總貢獻(xiàn)率為96.29%，大于95%，說(shuō)明所受干擾很小。PC1 相對(duì)穩(wěn)定，與酶解液相比都有明顯的變化，在加鹽量為10%出現(xiàn)了最大值。PC2 則隨著加鹽量的增加，逐漸下降，呈減少的趨勢(shì)。各組數(shù)據(jù)區(qū)域間沒(méi)有重疊，說(shuō)明不同發(fā)酵時(shí)間的酶解液的風(fēng)味成分可以通過(guò)PCA 很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。綜合評(píng)定，酶解液和發(fā)酵脫腥液比較，前后的風(fēng)味成分有明顯的變化，說(shuō)明發(fā)酵能改善酶解液的風(fēng)味[18]。從氣味上來(lái)說(shuō)，每組的發(fā)酵味都相對(duì)較淡；從滋味上來(lái)說(shuō)，加鹽量為5%的入口很淡，加鹽量為10%和20%的開(kāi)始嘗不出苦澀腥味，但后續(xù)就會(huì)有較明顯的苦澀腥味，且20%加鹽量咸味過(guò)重，加鹽量為15%時(shí)分值最高，最容易被人接受。因此，15%的加鹽量最佳。

圖3 不同發(fā)酵溫度酶解液的PCA 圖Fig.3 PCA diagram of enzymatic hydrolysate at different fermentation temperature

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)酶解液的感官評(píng)價(jià)Fig.4 The sensory evaluation of enzymatic hydrolysate at different fermentation temperature

圖5 不同加鹽量酶解液的PCA 圖Fig.5 PCA diagram of enzymatic hydrolysate with different amounts of salt

圖6 不同加鹽量酶解液的感官評(píng)價(jià)Fig.6 The sensory evaluation of enzymatic hydrolysate with different amounts of salt

2.4 酶解工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及條件驗(yàn)證

2.4.1 酶解工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。由極差分析可知，經(jīng)L9（33）正交試驗(yàn)后，得到最優(yōu)組合條件為脫腥時(shí)間12 h、脫腥溫度35 ℃、加鹽量15%，其順序?yàn)镃2B1A2。

2.4.2 最優(yōu)組合條件驗(yàn)證 稱取一定量的酶解液，按其質(zhì)量的2%，15%和0.1%添加葡萄糖、鹽和酵母，于35 ℃下恒溫培養(yǎng)12 h 后，制備得到發(fā)酵脫腥液，測(cè)得發(fā)酵脫腥液氨基酸態(tài)氮含量為0.2685 g/100 mL，高于正交試驗(yàn)中的所有組分測(cè)得的氨基酸態(tài)氮值，說(shuō)明試驗(yàn)具有可靠性。

2.5 酶解液電子鼻分析

對(duì)鱈魚骨的酶解液和脫腥液電子鼻分析結(jié)果如圖7所示。由圖可知，PC1 的貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，第2 主成分的貢獻(xiàn)率為0%，總貢獻(xiàn)率為99.996%，大于95%，說(shuō)明所受干擾很小，表明2 個(gè)主成分已經(jīng)基本代表了樣品的主要信息特征。圖中，酶解液與脫腥液PC1 變化穩(wěn)定，有明顯的上升趨勢(shì)，PC2基本沒(méi)變化，但其所占面積較廣，呈橢圓形，說(shuō)明數(shù)據(jù)信息比較分散，測(cè)定存在誤差。其次，脫腥前后樣品的揮發(fā)性風(fēng)味差異明顯，而此差異能在PC1、PC2 構(gòu)建的平面上充分展示，并且在平面上分布很有規(guī)律性，隨著溫度的升高，樣品沿PC1 軸向右分布。各組數(shù)據(jù)區(qū)域間沒(méi)有重疊，說(shuō)明酶解液與脫腥液的風(fēng)味成分可以通過(guò)PCA 很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)[18]。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results

圖7 脫腥反應(yīng)前、后酶解液的PCA 圖Fig.7 PCA diagram of the enzymatic hydrolysate before and after deodorization

2.6 酶解液SPME/GC-MS 分析

酶解液和發(fā)酵脫腥液的GC-MS 結(jié)果見(jiàn)表5。從表可知，酶解液發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分發(fā)生了變化，酶解液中共檢測(cè)到9 種香氣活性化合物，其中包括醛類4 種、酮類2 種、醇類1 種、醚類1種、吡嗪類1 種。經(jīng)過(guò)發(fā)酵脫腥后，發(fā)酵脫腥液香氣活性化合物明顯增多，檢測(cè)到18 種香氣活性化合物，其中包括醇類6 種、醛類4 種、吡嗪類3 種、酮類2 種、呋喃類2 種、酚類1 種。

如表5所示，發(fā)酵前后醛類物質(zhì)數(shù)量無(wú)變化，其中有惡臭的3-甲硫基丙醛變成了癸醛，有苦杏仁味的苯甲醛含量減少，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中，醛類物質(zhì)含量的減少可能是因?yàn)槿儆诓环€(wěn)定的中間體化合物，容易在發(fā)酵過(guò)程中被氧化和還原形成相應(yīng)的酸或醇[19]。醛類具有較低的閾值，能給予清香、果香和堅(jiān)果香的芳香特質(zhì)，是食品中重要的揮發(fā)性成分[20]。

醇類通常具有植物香、芳香氣味，是發(fā)酵過(guò)程中的主要成分。醇類化合物的閾值較高，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[21]。經(jīng)發(fā)酵后，一是醇類物質(zhì)種類明顯增多，占總量的77.80%?？赡苁怯芍舅岬拇渭?jí)氫過(guò)氧化物的分解[22]、脂質(zhì)氧化酶對(duì)脂肪酸的作用[23]、脂肪的氧化分解生成或由羰基化合物還原生成醇[24]，脫氫酶也可以將由脂肪酸和氨基酸生成的醛還原成相應(yīng)的醇[25]。其次，醇類物質(zhì)可能來(lái)源于酵母發(fā)酵過(guò)程中有氧呼吸和無(wú)氧呼吸時(shí)產(chǎn)生。

表5 酶解液GC-MS 測(cè)定結(jié)果Table 5 The results of GC-MS determination of enzymatic hydrolysate

酮類另一種重要的呈味物質(zhì)對(duì)溶液風(fēng)味變化也起著重要作用。如表所示酮類物質(zhì)種類無(wú)變化，但含量減少，適量的酮類貢獻(xiàn)甜的花香和果香風(fēng)味，而過(guò)量的酮類則會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕?。酮類主要是脂肪酸的自?dòng)氧化或由Strecker 反應(yīng)產(chǎn)生的氨基酸降解形成的[21]。另外，呋喃作為肉制品中的重要雜環(huán)，也可能影響魚骨酶解液的香氣。

2.7 發(fā)酵脫腥液氨基酸分析

最優(yōu)組發(fā)酵脫腥液氨基酸組成及主要呈味特性[26-27]見(jiàn)表6，測(cè)得氨基酸總量為6 177.28 mg/100 g。由表6可知，谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸這3 種氨基酸的含量明顯高于其它氨基酸，而甘氨酸、賴氨酸等必需氨基酸的含量也較高，酪氨酸含量最低，它們分別占總量的14.23%，11.06%，9.19%，8.26%，7.81%，2.20%。發(fā)酵液呈鮮、甜氨基酸占總量的58.2%，產(chǎn)品鮮味突出，可能是酶解液中的小分子多肽起了主要鮮味作用或產(chǎn)生的醇厚感肽對(duì)鮮味起了增強(qiáng)作用，同時(shí)說(shuō)明耐鹽酵母發(fā)酵對(duì)改善脫腥液風(fēng)味有著較大的作用。

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)確定了鱈魚骨酶解液脫腥苦的最佳工藝：發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間12 h、加鹽量15%。電子鼻的PCA 圖說(shuō)明發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)有很明顯的變化，可以很好地區(qū)分發(fā)酵前后的酶解液風(fēng)味。通過(guò)SPME/GC-MS 對(duì)脫腥反應(yīng)前后香氣化合物成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)脫腥反應(yīng)可以明顯增加酶解液的風(fēng)味成分，尤其是香氣活性化合物明顯增多，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為醛類、酮類、酚類、醇類、呋喃等化合物。氨基酸的測(cè)定結(jié)果表明：谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸這3 種氨基酸的含量明顯高于其它氨基酸，而它們分別代表鮮味和甜味，充分說(shuō)明發(fā)酵對(duì)酶解液脫腥苦起著重要的作用。本研究建立了酶解液脫腥苦工藝，為其深加工及高值化利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

表6 氨基酸成分含量表Table 6 Amino acid content