一株植物乳桿菌體內(nèi)降膽固醇的作用機(jī)制

靳 妲 馬微微

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 哈爾濱150040）

他汀類(lèi)藥物是臨床上常用的改善高膽固醇血癥的藥物，然而長(zhǎng)期服用他汀類(lèi)藥物可能造成肌肉疼痛、疲勞，還可能提高糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]，因此益生菌療法走進(jìn)人們的視野。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主有益的活性微生物”[5]。乳酸菌在人類(lèi)腸道系統(tǒng)中的代謝和功能性質(zhì)對(duì)人類(lèi)的健康有很大的益處。有很多研究證明益生菌具有降膽固醇的作用。2009年，Jungae Jeun 等[6]在基因水平上證明了植物乳桿菌具有明顯的降膽固醇功效。2016年，Damodharan K 等[7]用瑞士乳桿菌發(fā)酵酸乳，在體內(nèi)和基因水平上證實(shí)乳桿菌的降膽固醇作用。

植物乳桿菌KLDS1.0386 分離自中國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，有研究證明KLDS1.0386 具有體外降膽固醇能力、良好的胃腸拮抗性和粘附性[8-9]。本試驗(yàn)通過(guò)建立C57BL/6 小鼠高膽固醇模型研究此菌株的降膽固醇能力，利用蛋白免疫印記法測(cè)定其對(duì)小鼠肝臟膽固醇調(diào)節(jié)的幾個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，為開(kāi)發(fā)具有降膽固醇功能的益生菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

總膽固醇檢測(cè)試劑盒、甘油三酯檢測(cè)試劑盒、高密度脂蛋白檢測(cè)試劑盒、低密度脂蛋白檢測(cè)試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司；CYP7A1一抗、LDLR 一抗、FXR 一抗、SREBP2 一抗，Santa Cruz；HMGCR 一抗，Abcam；β-actin 一抗，北京博奧森；普伐他汀鈉片，第一三共制藥有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

BCN1360 型生物潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器公司；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋HVE-50，HIRAYAMA 公司；超低溫冰箱，SANYO 轉(zhuǎn)移脫色搖床，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；低溫離心機(jī)，Eppendorf 公 司；UVP 凝 膠 成 像 系 統(tǒng)，Thermo公司；電泳儀，北京六一；半干轉(zhuǎn)膜儀，ATTO 公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，MILTON ROY COMPANY公司；超純水儀，北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司；美國(guó)UVP 分析儀。

1.3 乳酸菌與培養(yǎng)基

植物乳桿菌KLDS1.0386（Lactobacillus plantarum）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。供試菌株在試驗(yàn)前需進(jìn)行復(fù)蘇與純化，經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，連續(xù)傳代3 次以恢復(fù)菌種活力用于后續(xù)試驗(yàn)。

MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨 5.0 g，牛肉膏5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 g，酵母粉5.0 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，用蒸餾水溶解后定容至1 L，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠的分組與飼養(yǎng) 6 周齡C57BL/6 雄性小鼠購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，將40 只小鼠按平均體質(zhì)量無(wú)顯著差異隨機(jī)分成5 組，每組8 只：空白組、高膽固醇模型組、KLDS1.0386 低劑量組、KLDS1.0386 高劑量組、普伐他汀對(duì)照組（見(jiàn)表1）?？瞻捉M小鼠喂普通基礎(chǔ)飼料，其它4 組小鼠喂高膽固醇飼料，培養(yǎng)30 d，建立高膽固醇模型小鼠。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度45%～50%，自由采食與飲水，12 h 光-暗循環(huán)。

供試樣品通過(guò)灌胃的方式給予小鼠，將活化好的植物乳桿菌KLDS1.0386 按2%的接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，經(jīng)3 000 r/min 離心10 min 獲得培養(yǎng)菌株，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次，最后用無(wú)菌生理鹽水重懸調(diào)至109，1010CFU/mL，分別作為低劑量組和高劑量組[6]。普伐他汀按小鼠3 mg/kg 體重劑量給藥[10]。空白組和高膽固醇模型組以無(wú)菌生理鹽水代替。各組按照每只小鼠1 mL/100 g 體重的劑量灌胃，每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃4 周。

激光剝蝕技術(shù)(LA)作為一種應(yīng)用于大部分固體樣品的引入方法，與干擾少、靈敏度高的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)聯(lián)用，可以避免溶液制備中的稀釋效應(yīng)，對(duì)降低方法檢出限更為有利。該技術(shù)僅僅需要極少的樣品消耗量，可以實(shí)現(xiàn)微區(qū)分析和微損分析[1-9]。Christopher L[1]等人用此項(xiàng)技術(shù)成功地分析了鎂合金表面元素的分布。本文以63Cu的強(qiáng)度穩(wěn)定且達(dá)到最大值為考察依據(jù)，對(duì)激光剝蝕的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳儀器參數(shù)，并通過(guò)計(jì)算各雜質(zhì)元素的相對(duì)靈敏度因子(RSF)[10]，最終實(shí)現(xiàn)了LA-ICP-MS內(nèi)標(biāo)定量法對(duì)純銅中Fe、Zn、As、Sn、Sb、Pb、Bi共7種痕量元素的測(cè)定。

高膽固醇根據(jù)文獻(xiàn)[11]改良后自行配制，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司制造。

基礎(chǔ)飼料配方：面粉20%，麩皮25%，玉米20%，米粉10%，豆料20%，魚(yú)粉2%，骨粉2%，食鹽0.9%，維生素0.1%。

高膽固醇飼料：膽固醇3%，膽鹽0.3%，豬油10%，蛋黃粉5%，基礎(chǔ)飼料81.7%。

表1 各組別小鼠飲食情況對(duì)照表Table 1 The diet compositions for mice of the different groups

1.4.2 血液采集與血脂檢測(cè) 小鼠灌胃第28 天取血，小鼠采血前禁食12 h。采取毛細(xì)玻璃管眼眶后靜脈叢取血方法，室溫放置1 h。4 000 r/min 離心5 min，收集血清，采用酶法檢測(cè)試劑盒利用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇濃度。

1.4.3 Western-blotting 檢測(cè) 小鼠灌胃第28 天進(jìn)行解剖取肝臟，肝臟取出后裝進(jìn)無(wú)菌凍存管中，迅速放入液氮中防止蛋白降解。選取5 種肝臟膽固醇代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因作為檢測(cè)對(duì)象，即HMGCR、CYP7A1、LDLR、FXR 和SREBP2。送樣至成都楊克斯生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Western-blotting 試驗(yàn)，分析供試菌株對(duì)肝臟膽固醇代謝的影響。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用SPSS 20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行多組數(shù)據(jù)之間的比較，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血脂分析

小鼠血清膽固醇水平變化直接反應(yīng)供試菌株的體內(nèi)降膽固醇效果，分別檢測(cè)了不同飲食處理組小鼠血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白濃度，結(jié)果如表2所示。

本試驗(yàn)通過(guò)采食高膽固醇飼料，30 d 后成功構(gòu)建出高膽固醇小鼠模型。通過(guò)灌胃植物乳桿菌KLDS1.0386，28 d 后，在血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白水平上，與高膽固醇對(duì)照組相比，灌胃KLDS1.0386 低劑量組和高劑量組均有所下降，尤其是高劑量組，與高膽固醇對(duì)照組相比均屬于明顯差異（P＜0.05），分別下降了23.61%，16.97%和31.11%，高密度脂蛋白水平變化不顯著（P＞0.05），這與已報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似。Jungae Jeun 等[6]以C57BL/6 小鼠為模型，每天灌胃濃度為109CFU/mL 活性的植物乳桿菌和1010CFU/mL 失活的植物乳桿菌，維持4 周，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平顯著下降42%和32%。丁盼盼等[12]采用一株從羊糞中提取的植物乳桿菌灌胃小鼠，為期30 d，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，小鼠血清膽固醇、甘油三酯水平分別下降了31.3%和20.44%。

表2 不同飲食處理小鼠血清膽固醇水平Table 2 The cholesterol levels in the serum of mice fed a different diet

2.2 Western-blotting 檢測(cè)

Western-blotting 檢測(cè)菌株KLDS1.0386 對(duì)高膽固醇模型C57BL/6 小鼠肝臟膽固醇相關(guān)代謝基因在蛋白水平表達(dá)的影響，如圖1所示。

圖1 不同飲食處理小鼠肝臟相關(guān)蛋白表達(dá)的免疫印跡分析Fig.1 Western blot of protein expression in the liver of mice fed a different diet

2.2.1 HMGCR 蛋白表達(dá)量水平分析 HMGCR是肝臟膽固醇合成的限速酶，降低HMGCR 的表達(dá)可以抑制體內(nèi)膽固醇水平[13]，研究顯示，高脂飲食對(duì)HMGCR 的表達(dá)具有抑制作用，這可能是由于體內(nèi)膽固醇水平上升過(guò)快，而對(duì)HMGCR 導(dǎo)致的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，以防止更多的膽固醇合成。如圖2所示，與單純的進(jìn)食高膽固醇飼料相比，劑量組小鼠HMGCR 蛋白表達(dá)量要更低一些，尤其是高劑量組，明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這說(shuō)明植物乳桿菌KLDS1.0386 可以通過(guò)抑制HMGCR 的表達(dá)來(lái)降低體內(nèi)膽固醇水平。

2.2.2 SREBP2 蛋白表達(dá)量水平分析 SREBP2是SREBPs 家族的成員之一，主要用于膽固醇合成的調(diào)節(jié)，是HMGCR 和LDLR 的上游基因[14]，可促進(jìn)其表達(dá)。如圖3所示，與模型組相比，高低劑量組表達(dá)并沒(méi)有明顯差異，而Kim 等[15]采用大鼠動(dòng)物模型，灌胃植物乳桿菌發(fā)酵豆乳，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，灌胃豆乳的大鼠的SREBP2 蛋白表達(dá)量明顯下降，這與本試驗(yàn)結(jié)果不符，可能是由于菌種特異性的緣故，KLDS1.0386 可能通過(guò)其它途徑去調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平。

圖2 不用飲食處理小鼠肝臟HMGCR 蛋白表達(dá)的免疫印跡分析Fig.2 Western blot of HMGCR protein expression in the liver of rats fed a different diet

2.2.3 LDLR 蛋白表達(dá)量水平分析 LDLR 是一種細(xì)胞表面糖蛋白，大多存在于組織細(xì)胞中，其可以將血液中的低密度脂蛋白膽固醇吞進(jìn)肝細(xì)胞中來(lái)保持膽固醇平衡，過(guò)度的膽固醇則可能抑制LDLR 的表達(dá)，而有些降脂藥就是通過(guò)升高LDLR的表達(dá)來(lái)完成其作用機(jī)制[16]。如圖4所示，與模型組相比，高低劑量組小鼠LDLR 表達(dá)量有所上升，但差異不顯著，這可能與KLDS1.0386 對(duì)SREBP2的作用不顯著有關(guān)，普伐他汀組與其它4 組相比表達(dá)量明顯增加，由此說(shuō)明，KLDS1.0386 并不是通過(guò)調(diào)節(jié)LDLR 的表達(dá)降低膽固醇水平。

圖3 不用飲食處理小鼠肝臟SREBP2 蛋白表達(dá)的免疫印跡分析Fig.3 Western blot of SREBP2 protein expression in the liver of rats fed a different diet

2.2.4 CYP7A1 蛋白表達(dá)量水平分析 CYP7A1是膽固醇代謝經(jīng)典途徑中的限速酶，其催化膽固醇合成7α-膽固醇，經(jīng)過(guò)一系列酶反應(yīng)形成膽汁酸，研究顯示，CYP7A1 的表達(dá)受到抑制會(huì)導(dǎo)致膽汁酸合成的下降，從而升高體內(nèi)膽固醇水平，而食物中的膽固醇和內(nèi)源性膽固醇都可以提高CYP7A1 的表達(dá)[17]。如圖5所示，與單純進(jìn)食高膽固醇飼料相比，灌胃益生菌的兩組小鼠CYP7A1的表達(dá)量有所升高，尤其是高劑量組，與模型組形成顯著差異 （P＜0.05），這說(shuō)明KLDS1.0386 升高CYP7A1 的表達(dá)量，加速了肝臟中膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)移，反饋降低體內(nèi)膽固醇水平。

2.2.5 FXR 蛋白表達(dá)量水平分析 FXR 是CYP7A1 的上游基因，F(xiàn)XR 的表達(dá)量上升會(huì)導(dǎo)致FXR 與膽汁酸結(jié)合形成膽汁酸-FXR 復(fù)合物，此復(fù)合物可以反過(guò)來(lái)與CYP7A 基因結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，CYP7A 基因負(fù)責(zé)限速酶CYP7A1 的轉(zhuǎn)錄，從而CYP7A1 轉(zhuǎn)錄也被抑制，導(dǎo)致膽固醇合成膽汁酸減少，體內(nèi)膽固醇水平上升[18]。如圖6所示，灌胃KLDS1.0386 后，F(xiàn)XR 的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，尤其是高劑量組，與模型組形成顯著差異 （P＜0.05），而KLDS1.0386 具有膽鹽水解酶活性[8]，由此可推測(cè)，CYP7A1 表達(dá)量的升高可能是由于FXR 表達(dá)的抑制導(dǎo)致的，而FXR 表達(dá)量的抑制可能是由于KLDS1.0386 產(chǎn)生的膽鹽水解酶使體內(nèi)產(chǎn)生更多游離型膽汁酸，而非游離型膽汁酸減少的緣故。

圖5 不用飲食處理小鼠肝臟CYP7A1 蛋白表達(dá)的免疫印跡分析Fig.5 Western blot of CYP7A1 protein expression in the liver of rats fed a different diet

圖6 不用飲食處理小鼠肝臟FXR 蛋白表達(dá)的免疫印跡分析Fig.6 Western blot of FXR protein expression in the liver of rats fed a different diet

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明植物乳桿菌KLDS1.0386 通過(guò)抑制小鼠肝臟HMGCR 蛋白表達(dá)與通過(guò)下調(diào)小鼠肝臟FXR 蛋白的表達(dá)激活CYP7A1 的表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平，為開(kāi)發(fā)具有降膽固醇特性的益生菌提供了理論基礎(chǔ)，為生產(chǎn)降膽固醇發(fā)酵乳制品提供了理論依據(jù)。