類蛋白反應(yīng)修飾的牡蠣肽鋅結(jié)合物的生物利用性

王再揚 曹玉惠 趙元暉* 崔永日 薛長湖 曾名湧

（1 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266003 2 青島康邁臣生物科技有限責(zé)任公司 山東青島266105）

牡蠣是世界第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之首。據(jù)2016年中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年我國牡蠣產(chǎn)量為457 萬t[1]，占世界總量的75%以上。牡蠣體內(nèi)蛋白質(zhì)含量豐富，有“海洋牛奶”之稱。酶解牡蠣蛋白制備活性肽是其高值化利用的有效途徑之一。針對牡蠣源活性多肽的研究受到研究者的青睞。余杰等[2]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣活性多肽BPO 能誘導(dǎo)宮頸癌HeLa 細(xì)胞的凋亡，實現(xiàn)抗腫瘤的作用。牡蠣還含有豐富的礦質(zhì)元素，尤其是鈣和鋅含量，并且牡蠣軟體中的氨基酸或多肽能與部分鋅形成復(fù)合物，進(jìn)而間接表明牡蠣蛋白酶解液很可能具有較高的鋅離子螯合活性。

類蛋白反應(yīng)是濃縮的蛋白水解物在合適條件下經(jīng)蛋白酶作用形成凝膠狀物質(zhì)的反應(yīng)[3-4]。沈晴晴等[5]通過類蛋白反應(yīng)修飾海地瓜的酶解物，獲得一條高活性的ACE 抑制肽。Ono 等[6]應(yīng)用Acalase催化的類蛋白反應(yīng)修飾烏賊蛋白水解物，最終提高了該水解物的抗氧化活性。目前多數(shù)研究是利用類蛋白反應(yīng)修飾改善酶解液活性，而未對修飾肽的活性與結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系進(jìn)行探究。本項目組早期從牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物中得到HLRQEEKEEVTVGSLK 鋅結(jié)合活性肽[7]，其鋅結(jié)合能力為6.56 mg/g。張娟娟[8]通過在類蛋白反應(yīng)中添加外源氨基酸Tyr、Pro、Trp、Phe、Leu 等，控制反應(yīng)條件，制備出具有較高鋅結(jié)合能力的牡蠣源活性肽（EVPPEEH），其鋅結(jié)合能力為161 mg/g，是原牡蠣酶解活性肽（HLRQEEKEEVTVGSLK）的25 倍。由此可見，酶法制備鋅結(jié)合肽的較低結(jié)合能力已成為其研究與開發(fā)的瓶頸。類蛋白反應(yīng)在改善多肽功能性和食物蛋白營養(yǎng)性方面顯示出巨大的潛力，具有無需添加任何有機溶劑或化學(xué)試劑的優(yōu)點，必將在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。

鋅是人和動物所需重要的微量元素之一，具有重要生物功能[9]。機體缺鋅會導(dǎo)致基礎(chǔ)代謝下降，影響生長發(fā)育等多方面的負(fù)面影響[10]。研究表明有機鋅接近于機體內(nèi)鋅的功能作用形式，其生物學(xué)利用效率比無機鋅高[11]。肽類是近年來廣受食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域關(guān)注的具有生物活性物質(zhì)。斯開興等[12]發(fā)現(xiàn)帶魚酶解肽亞鐵螯合物能顯著改善大鼠貧血狀況。肽鋅復(fù)合物相對于傳統(tǒng)的補鋅產(chǎn)品具有高穩(wěn)定性、高生物效價和高吸收率，已成為國內(nèi)外研究的重點[13]。本研究通過構(gòu)建缺鋅型SD 大鼠模型，灌胃不同形式的鋅源一段時間，以SD 大鼠體重、血清及各臟器鋅含量和小腸轉(zhuǎn)鋅蛋白及小肽轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)量來探討牡蠣源類蛋白反應(yīng)修飾肽鋅結(jié)合物的補鋅效果和吸收途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 太平洋牡蠣，青島齊東路水產(chǎn)市場；多肽M（EVPPEEH），上海淘普科技有限公司合成，純度99%；胃蛋白酶，丹麥諾維信公司；硫酸鋅；谷氨酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Chelax-100 樹 脂，美 國BIO-RAD 公 司；ZnT1、PepT1 ELISA 試劑盒，美國 Cloud-Clone Corp 公司；總蛋白定量試劑盒，南京建成生物工程研究所；無特定病原體級雄性SD 大鼠，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)公司；未特別說明，本研究所用的其它試劑均為分析純以上。

1.2 樣品的制備

1.2.1 牡蠣酶解肽制備 取牡蠣軟體，洗凈，均質(zhì)，均質(zhì)液于100 ℃滅酶10 min，調(diào)節(jié)pH 至2.0，加入1.5% （m/m）的胃蛋白酶于37 ℃反應(yīng)2.5 h，酶解結(jié)束后100 ℃滅酶10 min。pH 調(diào)至7.0，于6 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清過0.45 μm的微孔濾膜，收集濾液過chelax-100 交換樹脂層析柱脫鹽，真空冷凍干燥后得到牡蠣肽。

1.2.2 類蛋白反應(yīng)修飾肽牡蠣酶解肽的制備 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的多肽溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的胃蛋白酶、1%的谷氨酸于pH=5.0，T=37 ℃條件下反應(yīng)1.5 h 后100 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫，真空冷凍干燥得到類蛋白反應(yīng)修飾的牡蠣肽。

1.2.3 多肽鋅結(jié)合物的制備 將多肽溶于超純水配制成5%的多肽溶液，按多肽與鋅鹽的質(zhì)量比為3∶1 加入ZnSO4，于pH=6.5，T=37 ℃條件下反應(yīng)30 min。加入4 倍體積的無水乙醇除去游離的鋅離子，真空冷凍干燥即得肽鋅復(fù)合物。

1.2.4 鋅含量測定 鋅螯合活性測定參照文獻(xiàn)[14]中的方法并做適當(dāng)修改。多肽與鋅鹽反應(yīng)后參照文獻(xiàn)[3]的方法，加入4 倍體積的無水乙醇除去游離的鋅離子，將沉淀真空冷凍干燥后采用火焰原子吸收法測定其中鋅離子含量，另外采用Folin-酚法測定多肽含量。

1.3 動物試驗

1.3.1 動物分組 取60 只雄性的SD 大鼠（體重100～120 g）經(jīng)1 d 的適應(yīng)后，將60 只大鼠隨機分為6 組，每組10 只。PF 組為正常組，其余5 組為試驗組。

1.3.2 缺鋅造模 除PF 組外，其余5 組均飼喂低鋅飼料和去離子水，飼喂期為4 周。無外源鋅添加的AIN-93G 模型飼料（鋅含量低于1 mg/kg）和正常飼料（鋅含量38 mg/kg）均由飼料生產(chǎn)商南通特洛菲飼料科技有限公司提供。

1.3.3 給藥 缺鋅模型構(gòu)建成功后，根據(jù)課題組前期研究結(jié)果，按照714 μg/（kg·d）（WZn/WRat）的灌胃劑量對試驗組進(jìn)行灌胃處理。ZD 組繼續(xù)飼喂低鋅飼料且同時灌胃生理鹽水，ZS 組灌胃硫酸鋅（陽性對照組），OPZ 組灌胃牡蠣酶解肽鋅結(jié)合物，LPZ 組灌胃類蛋白反應(yīng)修飾的牡蠣酶解肽鋅結(jié)合物，MZ 組灌胃純肽鋅結(jié)合物，這一階段的飼喂周期為2 周。飼養(yǎng)期一旦結(jié)束，待大鼠空腹24 h 后乙醚麻醉處死后，取得所需的組織器官。

1.3.4 指標(biāo)測定

全詩想象奇特，雖是題畫之作，卻出入于畫面之外。首二句用夸張之語營造一種雄闊之勢，三、四句由整體轉(zhuǎn)向局部，描繪出峰頭禿樹萬笏朝天之勢。中間六句通過箕山老人前后氣色的轉(zhuǎn)變再次凸顯蓬萊峰的雄壯氣勢。接下來兩句用“忽然”一詞將觀者的視線由峰頂引至海邊平地。整幅畫面，有萬仞之高的險峰，有平如江海般的平地。一高一低，一險一緩，給人以強烈的視覺沖擊。后四句由畫闡發(fā)自我感悟，青峰、明月何須購買，本屬萬物。最后兩句化用蘇軾“我攜此石歸，袖中有東海”之句，與首句呼應(yīng)。

1.3.4.1 大鼠體重、毛色和精神狀態(tài) 飼喂期間每天對大鼠進(jìn)行表觀現(xiàn)象觀察包括毛色、皮膚、飼料攝入情況等等。并從灌胃開始，每天對它們的體重和食量進(jìn)行稱量和記錄。

1.3.4.2 血液指標(biāo)測定 將大鼠麻醉后腹主動脈取血5 mL，低溫靜置30 min 后，離心（3 500 r/min，10 min，4 ℃）取血清，置原子吸收分光光度儀測定血清中鋅含量。

1.3.4.3 各組織中鋅含量 大鼠處死后取其肝臟、腎臟、脾臟及股骨，分別用生理鹽水洗去血漬，置于90 ℃烘箱烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取烘干樣品1.0 g （0.5～1.5 g）于玻璃消解管中，加入15 mL 消化液（高氯酸∶濃硝酸=1∶3，V/V），放置在電熱消解儀上進(jìn)行程序消化。經(jīng)消解后樣品用超純水定容至10 mL 待測，稀釋至合適濃度，用原子吸收分光光度計測得準(zhǔn)確鋅含量。

1.3.4.4 大鼠小腸ZnT1 和PepT1 蛋白表達(dá)水平測定 大鼠處死后取其十二指腸和空腸，用生理鹽水及PBS 緩沖液沖洗干凈后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用雙抗夾心法測定鋅轉(zhuǎn)運體和小肽轉(zhuǎn)運蛋白含量。步驟嚴(yán)格依照ELISA 試劑盒附帶的說明書進(jìn)行操作，最后于450 nm 用酶標(biāo)儀測定底物與酶發(fā)生反應(yīng)的光密度值。小腸樣品總蛋白含量用總蛋白定量試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。采用最小顯著差異法，在SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件中比較、分析均值的差異性，顯著性水平為5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺鋅造模階段SD 大鼠外觀變化

缺鋅模型構(gòu)建期間大鼠的外觀變化主要集中在眼瞼、爪子及毛發(fā)等部位。缺鋅組大鼠現(xiàn)出了稀便、啃毛、毛發(fā)稀疏、飼料浪費嚴(yán)重，個別大鼠出現(xiàn)眼瞼粘連及鼻孔出血的癥狀，體型瘦弱，體重和攝食量增加緩慢。正常組大鼠眼瞼表現(xiàn)出紅色，食欲旺盛，體重和攝食量持續(xù)增加，活動量明顯增加。模型組和正常組在外觀表現(xiàn)上差別非常明顯。

2.2 肽鋅結(jié)合物MZ 對大鼠生長的影響

由圖1可知缺鋅使大體重增長嚴(yán)重受限，缺鋅組大鼠兩周體重增重率僅為2%，進(jìn)行補鋅后MZ 組、LPZ 組、OPZ 組的大鼠體重增重率分別為72%，71%和66%顯著高于ZS 組（P＜0.05）。4 種補鋅組攝食量相對于缺鋅組也顯著增加。說明4 種補鋅方式均能顯著促進(jìn)大鼠生長改善前期的營養(yǎng)不良狀態(tài)，且MZ 的促進(jìn)效果要高于無機鋅組。Mingyan Jing 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)鋅缺乏大鼠生長緩慢，可能與缺鋅導(dǎo)致其攝食量減少相關(guān)，這與本研究的結(jié)果相似。Ao 等[16]研究發(fā)現(xiàn)給雛雞飼喂含硫酸鋅和蛋白鋅的飼料后體重增加并無顯著性差異。大鼠體內(nèi)鋅含量供應(yīng)充足時，缺鋅對大鼠生長的抑制作用將被抵消，這也解釋了不同鋅源對大鼠生長的促進(jìn)作用有相似的結(jié)果。

圖1 不同組別大鼠灌胃前后體重和攝食量變化情況Fig.1 Changes of body weight and food intake before and after gavage in different groups of rats

2.3 肽鋅結(jié)合物MZ 對大鼠血清鋅含量的影響

血清鋅是評價動物鋅營養(yǎng)狀況最普遍采用的指標(biāo)，它能在一定程度上反映不同鋅源的生物利用性。由圖2可知缺鋅組大鼠血液鋅含量顯著低于補鋅組（P＜0.05）且進(jìn)行補鋅恢復(fù)后，大鼠血清鋅含量呈恢復(fù)趨勢。MZ 組血清鋅分別恢復(fù)到（0.72±0.24）μg/mL、顯著高于LPZ 組、OPZ 組和ZS 組（P＜0.05）。其次LPZ 組顯著高于OPZ 組和ZS 組。趙洪雷、楊杰等[17]的研究結(jié)果顯示小肽鋅可以顯著提高昆明小鼠血清鋅含量，其補鋅效果優(yōu)于同劑量的葡萄糖酸鋅或硫酸鋅。且經(jīng)過類蛋白反應(yīng)修飾的牡蠣肽鋅結(jié)合物對于改善血清鋅含量的效果更好。

2.4 肽鋅結(jié)合物MZ 對大鼠股骨鋅含量的影響

大鼠生長的過程中伴隨著骨骼的發(fā)育，缺鋅會使大鼠骨骼中沉積的鋅含量降低[18]，由圖3可知缺鋅組大鼠骨骼鋅含量要明顯低于其補鋅組（P＜0.05）。進(jìn)行補鋅后3 種肽鋅結(jié)合物組大鼠股骨鋅含量顯著高于ZS 組（P＜0.05），這與陳達(dá)等[7]的研究結(jié)果相似，即牡蠣肽-鋅結(jié)合物的補鋅效果優(yōu)于無機鋅。MZ 組骨骼鋅含量最高，其次是LPZ組，二者均顯著高于OPZ 組和ZS 組（P＜0.05），其中MZ 組恢復(fù)到約PF 組的一半水平。說明MZ 大鼠缺鋅之后股骨鋅的消耗量低于各對照組，即MZ在大鼠體內(nèi)的利用率更高。

圖2 不同組別大鼠血清鋅含量Fig.2 Serum zinc content in different groups of rats

圖3 不同組別大鼠股骨鋅含量Fig.3 Femur zinc content in different groups of rats

2.5 肽鋅結(jié)合物MZ 對大鼠各臟器鋅含量的影響

肝臟、腎臟及脾臟是鋅代謝的主要器官，研究表明機體處于鋅攝入量低時，肝臟、腎臟等臟器中鋅的流失量相對較多。由圖4可知MZ 組肝臟鋅含量和腎臟鋅含量均顯著高于各對照組 （P＜0.05），比無機鋅組高出28%，比缺鋅組高出47%。LPZ 組和MZ 組脾臟鋅含量無顯著性差異，但都顯著高于OPZ 組和無機鋅組（P＜0.05），且基本恢復(fù)到正常水平。

圖4 不同組別大鼠各臟器鋅含量Fig.4 Zinc content of various organs in different groups

2.6 肽鋅結(jié)合物MZ 對大鼠小腸ZnT1 及PepT1 蛋白表達(dá)的影響

鋅轉(zhuǎn)運體ZnT1 主要表達(dá)部位在小腸絨毛細(xì)胞的基底膜表面，其主要功能是將鋅轉(zhuǎn)出細(xì)胞。大鼠小腸ZnT1 蛋白表達(dá)情況如圖5所示MZ 組、LPZ 組和OPZ 組大鼠小腸ZnT1 蛋白的表達(dá)量與ZS 組差異不是很明顯，但都顯著高于缺鋅組（P＜0.05）。如圖6小肽轉(zhuǎn)運蛋白PepT1 蛋白表達(dá)量MZ 組、LPZ 組和OPZ 組均顯著高于ZS 組 （P＜0.05），其中MZ 組PepT1 的蛋白表達(dá)量最高，相對于無機鋅組上調(diào)20%。這與Oestreicher 等[18]提出的肽鋅復(fù)合物可能通過肽的吸收機制被完整吸收的推斷相符合。

3 結(jié)論

圖5 不同鋅源對大鼠小腸鋅轉(zhuǎn)運體ZnT1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of different zinc sources on the expression of ZnT1 protein in rat small intestine zinc transporter

圖6 不同鋅源對大鼠小腸小肽轉(zhuǎn)運蛋白PepT1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of different zinc sources on the expression of PepT1 protein in rat small intestine zinc transporter

以牡蠣源多肽為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建缺鋅型SD 大鼠模型，研究了MZ 的生物補鋅性。結(jié)果表明MZ在促進(jìn)大鼠增重、維持大鼠血清鋅含量及各臟器鋅儲備量方面的效果均優(yōu)于OPZ 與硫酸鋅，牡蠣源肽（EVPPEEH）與鋅結(jié)合后促進(jìn)了鋅的吸收利用。鋅的主要吸收部位是小腸，腸道中可溶性鋅含量與人體鋅吸收量成正比[19]。MZ 進(jìn)入腸道后能減少食物組分對于鋅的競爭性結(jié)合，促進(jìn)了機體對于鋅的吸收。另外類蛋白反應(yīng)將谷氨酸等鋅結(jié)合能力強的氨基酸引入到牡蠣肽中，進(jìn)一步提高其與鋅結(jié)合能力和穩(wěn)定性。大鼠小腸轉(zhuǎn)鋅蛋白的表達(dá)情況也顯示MZ 組與ZS 組的ZnT1 蛋白表達(dá)量無差異，說明小腸ZnT1 的表達(dá)主要與鋅離子相關(guān)，MZ 促鋅經(jīng)小腸細(xì)胞轉(zhuǎn)運入血的效果與硫酸鋅相似，而多肽對于ZnT1 蛋白的表達(dá)可能不起作用。小肽轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)量MZ 組顯著高于硫酸鋅組，說明MZ 可通過肽的吸收機制被完整吸收，進(jìn)而提高了MZ 在大鼠體內(nèi)的生物利用性。Gefeller 等[20]也認(rèn)為，有機鋅既可以通過鋅轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)被吸收，也可以通過小肽或氨基酸的吸收機制被吸收?；诖宋諜C理，MZ 可能比傳統(tǒng)的補鋅產(chǎn)品更好地被人體吸收利用，即MZ 有望成為新型的補鋅產(chǎn)品。

綜上所述，MZ 的確具有很好的補鋅效果，后續(xù)工作將通過Caco-2 細(xì)胞單層模型，利用鋅螯合阻斷劑、熒光標(biāo)記肽鋅結(jié)合物以及多肽與鋅吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的基因表達(dá)情況，研究其體外生物可利用性，探討傳統(tǒng)的鋅吸收途徑和肽作用途徑分別在其生物利用中所占的比重及這兩種途徑之間是否存在協(xié)同作用。