石蒜堿通過調控MAPK/ERK信號通路抑制人結腸腺癌LoVo細胞生長*

張 平， 袁曉慧， 喻婷婷， 黃華坤, 楊春梅， 張露露， 羅小輯， 羅進勇△

(1重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室， 2重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科， 重慶 400016)

結直腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一。在我國，結直腸癌發(fā)病率及死亡率在全部惡性腫瘤中均位于第5名[1]，嚴重威脅人們的健康。目前臨床結直腸癌治療使用的化療藥物有很多，但轉移性結直腸患者5年生存率僅約10%[2]，這是由于劑量毒副作用及其對化療藥物反應的異質性等，這種異質性是由結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中不同原癌及抑癌基因的累積突變及復雜的信號通路改變等導致的。因此，探索安全有效的化療藥物對結直腸癌治療具有重要意義。石蒜堿(lycorine)是從中國廣泛分布的石蒜科中最早分離得到的石蒜屬植物生物堿，屬于異喹啉類生物堿，為吡咯并菲啶的衍生物，具有乙酰膽堿酯酶抑制、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗真菌、抗瘧疾和抗病毒等生物學作用[3]。此外，lycorine具有對多種器官腫瘤細胞的抗腫瘤活性，如膠質母細胞瘤[4]、肺癌[5]、膀胱癌[6]、前列腺癌[7]和肝癌[8]等，但對結直腸癌的影響機制尚不明確。因此，本項工作通過體外實驗檢測lycorine處理后人結腸腺癌LoVo細胞的增殖、凋亡和遷移侵襲能力改變情況，并探討其可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株 人結腸腺癌LoVo細胞株由重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室保存?zhèn)溆?，接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養(yǎng)箱。細胞生長至融合度70%～80%時，0.25%胰蛋白酶消化，細胞傳代。

1.2藥物與主要試劑 lycorine(純度≥98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司,用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解后于-20 ℃保存待用;CCK-8試劑盒購于Med Chem Express；基質膠購自BD Biosciences； Hoechst 33258染液購自Solarbio； LipofectamineTM2000轉染試劑購自Thermo Fisher；螢光素酶報告基因質粒pBGLuc Elk1/SRF TOP-Luc由美國芝加哥大學醫(yī)學中心分子腫瘤學實驗室何通川教授惠贈；螢光素酶檢測試劑盒購自New England Biolabs；結晶紫染液、蛋白提取試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；Transwell小室購自Millipore；兔抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、兔抗人cleaved caspase-3、兔抗人caspase-3、兔抗人基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)、鼠抗人E-cadherin、兔抗人N-cadherin、兔抗人ERK1/2、兔抗人p-ERK1/2和鼠抗人β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠 IgG購自中杉金橋有限公司。

1.3主要儀器 酶聯免疫檢測儀Eon為香港基因有限公司公司產品；倒置熒光顯微鏡ECLIPSE Ti-S為Nikon公司產品；流式細胞儀CytoFLEX為Beckman Coulter公司產品；化學發(fā)光成像儀ChemiDoc XRS+為Bio-Rad公司產品。

2 方法

2.1CCK-8法檢測lycorine對LoVo細胞的活力抑制作用 lycorine作用于人結腸癌HCT116細胞72 h后半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)約3.0 μmol/L[9]，其對多種腫瘤細胞的IC50在1～10 μmol/L[9-12]，因此本文采用1、2、4和8 μmol/L濃度梯度處理LoVo細胞，且以下實驗均同時設置空白對照組(0 μmol/L lycorine)及DMSO組(濃度為0.4%)。LoVo細胞以每孔3 000個的密度接種于96孔板，待細胞貼壁生長，lycorine處理細胞至24 h、48 h及72 h。按照CCK-8試劑盒操作說明書，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h。酶標儀測量波長450 nm處吸光度(A)值，計算細胞相對活力。細胞相對活力(%)=處理組A/空白對照組A×100%。

2.2劃痕愈合實驗檢測lycorine對LoVo細胞遷移的抑制作用 LoVo細胞接種于6孔板，待細胞融合度為 80%～90% 時，用10 μL 移液器吸頭在細胞面進行劃痕， PBS 漂洗 3 次，lycorine處理細胞，顯微鏡觀察記錄同一劃痕處0 h、12 h和24 h時點的變化，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.3Transwell小室實驗檢測lycorine對LoVo細胞侵襲的抑制作用 Transwell上室鋪基質膠(基質膠原液∶雙無培養(yǎng)液=1∶10)每孔30 μL。待基質膠凝固后，棄去上室雙無培養(yǎng)液。取對數生長期細胞，雙無培養(yǎng)液調整細胞密度為1.5×108/L。上室加入細胞懸液400 μL，并調整lycorine處理濃度，同時設置DMSO組，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)液。置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，結晶紫染液染色5 min, PBS洗滌去除殘余結晶紫染液，棉簽將上室內未穿過的細胞拭去。干燥后，顯微鏡下觀察記錄遷移到小室下層的細胞。

2.4Hoechst 33258染色法檢測lycorine對LoVo細胞凋亡的影響 LoVo細胞接種于24孔板，待細胞生長至密度為50%，lycorine處理細胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2次，4%多聚甲醛溶液固定細胞 20 min，PBS 洗滌2次，每孔加入 Hoechst 33258工作液(將原液稀釋100倍)200 μL，室溫避光反應5～7 min，棄去 Hoechst 33258工作液，PBS洗滌2次，倒置熒光顯微鏡下觀察記錄細胞核形態(tài)變化。當細胞發(fā)生凋亡時，凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染。

2.5流式細胞術檢測lycorine對LoVo細胞凋亡的影響 LoVo細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細胞生長至密度為50%，lycorine處理細胞24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，150×g轉速離心3 min。棄上清并加入3 mL PBS重懸細胞，重復2次，最后加入500 μL PBS重懸細胞。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒參考方法進行染色，最后經流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.6螢光素酶報告基因系統(tǒng)試驗檢測MAPK/ERK信號通路活性變化 LoVo細胞接種于 T25 培養(yǎng)瓶，待細胞融合度為 50%，將含10% FBS的培養(yǎng)液換為雙無培養(yǎng)液，LipofectamineTM2000 轉染螢光素酶報告質粒p-BGLuc Elk1/SRF TOP-Luc。轉染4 h后，換液為含10% FBS的培養(yǎng)液，細胞過夜培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化，細胞接種于24 孔板，待細胞融合度為 50%，不同濃度(2、4、8和12 μmol/L)lycorine處理細胞24 h，按照螢光素酶活性檢測試劑盒參考方法檢測各組熒光強度。MAPK/ERK信號通路激活后，核內Elk1/SRF轉錄因子磷酸化，進而調控靶基因表達。因此Elk1/SRF轉錄活性與MAPK/ERK信號通路活性正相關。各組螢光素酶活性值表示Elk1/SRF 轉錄活性，以此反映MAPK/ERK信號通路活性變化。

2.7Western blot 不同濃度(1、4和8 μmol/L)lycorine處理細胞24 h后，提取總蛋白。蛋白上樣，10% SDS-PAGE分離后，轉膜，5% BSA封閉液封閉2 h，Ⅰ抗置于4 ℃孵育過夜，洗膜3次，于37 ℃孵育HRP標記的Ⅱ抗，洗膜3次，化學發(fā)光顯影。顯影結果通過ImageJ軟件分析各電泳條帶的灰度值，以β-actin作為內參照，得出各蛋白的相對表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 5進行數據處理分析。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 lycorine抑制LoVo細胞的活力

CCK-8實驗結果顯示，LoVo細胞經1、2、4和8 μmol/L lycorine處理24 h、48 h及72 h后，與空白對照組對比，其細胞生長受到不同程度抑制，且具有濃度和時間依賴性(P<0.05);DMSO組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05),見圖1A。同時，Western blot結果顯示，lycorine使PCNA蛋白表達顯著下調(P<0.05),見圖1B。

2 lycorine對LoVo細胞凋亡無影響

Hoechst染色結果顯示,lycorine處理組LoVo細胞胞核與空白對照組形態(tài)相似，致密濃染或碎塊狀致密濃染少見，見圖2A。流式細胞術檢測結果表明，lycorine處理組早期及晚期凋亡率與空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖2B。Western blot證實，與空白對照組相比，lycorine處理組caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)，見圖2C。

3 lycorine抑制LoVo細胞遷移侵襲能力

劃痕愈合實驗結果顯示，2、4和8 μmol/L lycorine處理LoVo細胞24 h后，細胞劃痕愈合率較空白對照組顯著降低(P<0.05)，見圖3A。Transwell小室侵襲實驗結果顯示,lycorine處理組穿膜細胞數目較空白對照組顯著減少(P<0.05)，見圖3B。Western blot檢測,MMP-7和N-cadherin蛋白表達水平下調, E-cadherin蛋白表達水平上調(P<0.05)，見圖3C。

4 MAPK/ERK信號通路參與lycorine對LoVo細胞的調節(jié)

螢光素酶報告基因系統(tǒng)結果顯示，與空白對照組相比，4、8和12 μmol/L lycorine處理組螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見圖4A。Western blot檢測LoVo細胞中磷酸化ERK1/2蛋白水平顯著下調，同時ERK1/2總蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)，見圖4B。

Figure 1.Effects of lycorine on viability of LoVo cells. A: the viability of LoVo cells treated with different concentrations (1, 2, 4 and 8 μmol/L) of lycorine for 24 h, 48 h and 72 h was detected by CCK-8 assay; B: the protein level of PCNA was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖1 lycorine對LoVo細胞活力的影響

討 論

隨著結直腸癌患者的治療朝向個體化精準治療發(fā)展，術前及術后的輔助化療面臨新的，有效且毒副作用小的化療藥物需求。本研究探討的lycorine是從石蒜科植物中提取的一種天然成分，其具有多種合成衍生物及類似物，但lycorine展現出更高的抗腫瘤活性[12]。有研究顯示，lycorine對人胚肺成纖維W138細胞及人皮膚成纖維細胞(WS1和NHDF)產生毒性作用的濃度大于100 μmol/L[9]；與人支氣管上皮BEAS-2B細胞相比，lycorine對5種人腫瘤細胞株(骨髓白血病HL-60及K562細胞、肺癌A549細胞、肝細胞癌HepG2細胞和結腸癌HT-29細胞)的毒性選擇性指數高達10[13]。以上研究說明lycorine具有一定的選擇性細胞毒性作用，利于抗腫瘤治療應用。

本研究證實了lycorine對LoVo細胞生物學功能的抑制作用，且在一定濃度內呈劑量和時間依賴性。據報道，lycorine可通過抑制Wnt/β-catenin信號、逆轉上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及干預caspase介導的線粒體凋亡通路來抑制小細胞肺癌的生長和轉移[5]；通過阻斷STAT3信號通路及Src/FAK通路來抑制乳腺癌的增殖侵襲及促進凋亡[14-15]。但是對于部分腫瘤，lycorine通過細胞生長抑制而非細胞毒作用發(fā)揮其體外抗腫瘤活性，對凋亡抗性的腫瘤細胞是潛在的治療藥物[12]。本文結果顯示lycorine對LoVo細胞凋亡無影響，表明其主要發(fā)揮細胞生長抑制作用。本研究使用的結直腸癌LoVo細胞株具有高度的EMT，惡性程度高，且KRAS基因突變。在腫瘤轉移中，上皮腫瘤細胞可通過EMT獲得遷移侵襲能力，進而促進腫瘤發(fā)展[16]。本研究表明lycorine可通過上調E-cadherin及下調MMP-7和N-cadherin而抑制EMT過程，從而抑制LoVo細胞轉移。在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中，原癌基因KRAS突變是一個重要的分子事件。既往研究報道，約30%～40%的結直腸癌原癌基因KRAS發(fā)生突變，KRAS可作為判定結直腸癌惡性程度的分子指標之一[17-19]。KRAS是EGFR信號通路的下游組分之一，其異常突變會導致EGF/RAS/RAF/MEK/ERK持續(xù)激活[20]。而MAPK/ERK信號通路可調控細胞生長，存活及侵襲，與結直腸癌的進展密切相關，因此靶向MAPK/ERK是治療結直腸癌的一種方式[21]。本研究檢測lycorine顯著下調ERK1/2蛋白磷酸化水平，降低Elk1/SRF轉錄活性，提示lycorine對LoVo細胞的抗腫瘤作用與MAPK/ERK信號通路抑制有關。

Figure 2.Effects of lycorine on apoptosis of LoVo cells. A and B: the apoptosis of LoVo cells was detected by Hoechst staining and flow cytometry; C: the protein levels of caspase-3 and cleaved caspase-3 were detected by Western blot. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.

圖2 lycorine對LoVo細胞凋亡的影響

Figure 3.Effects of lycorine on migration and invasion abilities of LoVo cells. A and B: the inhibitory effect of lycorine on migration and invasion abilities of LoVo cells was tested by wound-healing assay and Transwell chamber assay (crystal violet staining); C: the protein expression of EMT-related markers was determined by Western blot. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖3 lycorine對LoVo細胞遷移和侵襲能力的作用

Figure 4.Effects of lycorine on activation of MAPK/ERK pathway in LoVo cells. A: after treatment with different concentrations of lycorine, the activity of MAPK/ERK signaling pathway was detected by luciferase reporter assay; B: the protein expression of p-ERK1/2 and total ERK1/2 was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖4 lycorine對LoVo細胞MAPK/ERK信號通路活性的影響

綜上所述，本研究通過體外實驗證實lycorine可通過抑制EMT過程及MAPK/ERK信號通路活性而降低LoVo細胞的增殖、遷移及侵襲能力，但對細胞凋亡無影響，提示其主要發(fā)揮細胞生長抑制作用。該研究可為結直腸癌治療提供一定參考資料。后續(xù)本課題組將進一步研究體內試驗并深入探討lycorine的作用機制以及與其他抗癌藥物聯合治療的效果。