骨保護素/脫蛋白骨復合物對兔前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的影響

粟玉斌 蔣堯傳 胡軍組 王洪凱 孫巖

前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)重要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，損傷后不易自我恢復，可導致關(guān)節(jié)軟骨面和半月板的損傷。ACL重建術(shù)是目前主要的治療方法，能有效恢復膝關(guān)節(jié)運動功能。目前常采用自體腘繩肌肌腱作為移植物，故肌腱與骨隧道的愈合，成為影響術(shù)后療效的關(guān)鍵。骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)在骨代謝過程中有著極其重要的生物學作用[1]，可用于ACL重建以提高手術(shù)療效。因有“滑液灌注效應”等的影響，所以單純應用OPG易造成流失[2]。脫蛋白骨(Deproteinized bone，DPB)是一種臨床上應用廣泛的載體材料[3]，具有良好的緩釋功能。本實驗將OPG復合于DPB后植入ACL重建動物模型中，觀察其對腱-骨早期愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.6±0.5)Kg，隨機分為 4 組(n=15)：即OPG組、DPB組、OPG/DPB組及對照組，均建立ACL重建模型，腱-骨界面分別植入OPG、DPB及OPG/DPB，對照組曠置處理。

1.2 OPG/DPB復合物的制作

根據(jù)文獻[4]的方法制備DPG，然后將DPB與OPG水溶液混合后4 ℃真空條件下放置4～6 h，讓OPG充分吸附于DPB，即制作成OPG/DPB復合物，存于4 ℃冰箱備用。

1.3 手術(shù)方法及處理

4組動物術(shù)前禁水、食8 h，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(2 mL/Kg)，左膝關(guān)節(jié)及左側(cè)跟腱部位備皮。ACL重建方法參照鄒國耀等[5]的報道。OPG組將100 μg OPG(每只動物)溶于水后分別于脛骨及股骨隧道內(nèi)注射，使其充分滲入松質(zhì)骨內(nèi)；DPB組采用克氏針將1 g DPB(每只動物)擠送入骨隧道內(nèi)，向隧道內(nèi)壁各個部位涂抹；OPG/DPB組每只動物同法植入100 μg OPG+1 g DPB復合物；對照組除ACL重建外不予任何處理。逐層縫合關(guān)閉切口，紗布包扎固定。術(shù)后前3天肌注青霉素(10萬U/只)抗感染，每天觀察傷口及一般情況，術(shù)后7 d拆線。

1.3 觀察指標

1.3.1一般情況

觀察術(shù)后存活、精神及活動、切口愈合等情況。

1.3.2解剖學大體觀察

觀察韌帶的外觀形態(tài)、張力情況及隧道口閉合情況。

1.3.3生物力學檢測

每組于術(shù)后4、8、12周隨機處死5只動物，截取完整膝關(guān)節(jié)。將股骨和脛骨殘端分別固定于INSTRON-4411 型生物力學測試儀上進行牽拉試驗(5.0 mm/s)，直到肌腱從骨隧道中拉出，記下脫出時的加載負荷。

1.3.4組織學觀察

術(shù)后4、8、12周取材后，石蠟包埋切片。HE染色觀察腱-骨界面各種組織細胞的分布情況。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有實驗動物均存活至實驗完成，術(shù)后精神及活動可，手術(shù)切口均愈合良好。

2.2 解剖學大體觀察

各組膝關(guān)節(jié)移植肌腱連續(xù)性好，與隧道壁連接完整。術(shù)后4周時，均填充以瘢痕組織。術(shù)后8周時，各組填充主要為軟骨組織，骨化最明顯是OPG/DPB組。術(shù)后12周時，以骨樣組織封閉的是OPG組、OPG/DPB組，DPB組和對照組骨化不明顯。

2.3 生物力學測試

術(shù)后4周時，最大加載負荷各組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術(shù)后8周時，最大加載負荷OPG/DPB組高于OPG組(P<0.05)，OPG組高于DPB組(P<0.05)和對照組(P<0.05)，DPB組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術(shù)后12周，各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 不同時間點各組生物力學檢測結(jié)果比較

2.4 組織學觀察

術(shù)后4周，OPG組腱-骨界面有少量含血管的纖維結(jié)締組織，排列疏松；DPB組的腱-骨結(jié)合不夠緊密，散在分布有新生骨細胞；OPG/DPB組腱-骨界面結(jié)合緊密，有較多含有血管的纖維結(jié)締組織；對照組腱-骨界面排列疏松，結(jié)合不緊密(圖1)。

術(shù)后8周，OPG組腱-骨界面可見Sharpey樣纖維，走行不規(guī)則，少許向肌腱內(nèi)長入；DPB組腱-骨偶有Sharpey樣纖維，結(jié)合疏松，排列無序；OPG/DPB組有零星的鈣化軟骨和骨組織，纖維排列較有序，較多新生骨組織長入肌腱；對照組少見Sharpey樣纖維，腱骨結(jié)合疏松(圖2)。

a：OPG組；b：DPB組；c：OPG/DPB組；d：對照組A:OPG group; B:DPB group; C:OPG / DPB group; D:Control group

a：OPG組；b：DPB組；c：OPG/DPB組；d：對照組A:OPG group; B:DPB group; C:OPG / DPB group; D:Control group

術(shù)后12周，OPG組可見大量Sharpey樣纖維，有較多骨性組織長入，局部可見鈣化的纖維軟骨；DPB組有少量新骨形成，肌腱與骨組織形成纖維軟骨連接；OPG/DPB組可見典型的4層結(jié)構(gòu)，但部分新生骨組織未成熟；對照組纖維軟骨明顯，但比OPG組差(圖3)。

a：OPG組；b：DPB組；c：OPG/DPB組；d：對照組A:OPG group; B:DPB group; C:OPG / DPB group; D:Control group

3 討論

ACL重建的關(guān)鍵是腱-骨愈合。腱-骨愈合是指在移植肌腱和骨之間的愈合，最終達到肌腱和骨之間結(jié)構(gòu)一體和功能連續(xù)的形式[6]。前交叉韌帶從韌帶向止點方向分別為韌帶、纖維軟骨、鈣化軟骨和骨[7]。而腱-骨愈合分為直接愈合和間接愈合[8]。韌帶重建后，腱-骨界面以間接愈合為主，由Sharpey樣纖維直接長入骨組織以獲得固定效果，在纖維軟骨與鈣化纖維軟骨之間由“潮線”相隔。

組織學觀察顯示，術(shù)后4周時，各組均未見Sharpey樣膠原纖維，由纖維結(jié)締組織填充；術(shù)后8周時，OPG/DPB組Sharpey樣膠原纖維最為明顯；術(shù)后12周時，OPG/DPB組可見典型4層結(jié)構(gòu)，表明OPG/DPB復合物對形成直接止點有促進作用。

術(shù)后24～32周重建的 ACL 的腱之間骨連接達到正常 ACL 的止點結(jié)構(gòu)。生物力學測試顯示，術(shù)后4周各組最大加載負荷差異無統(tǒng)計學意義；術(shù)后8周，OPG/DPB組最大加載負荷最高，有統(tǒng)計學意義；術(shù)后12周，各組差異無統(tǒng)計學意義。說明OPG/DPB復合物能有效增加腱-骨愈合能力。

促進腱-骨愈合的方法眾多，有細胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨膜等。OPG主要是通過抑制破骨細胞的發(fā)生并促進其凋亡。安明等[9]證實，OPG對交叉韌帶重建后腱-骨愈合有促進作用，但由于“滑液灌注效應”的影響，OPG易流失，故會影響早期肌腱和骨道壁之間纖維結(jié)締組織的形成。倪鋒等[10]的重建動物模型中，將腱-骨隧道填充磷酸鈣，避免了骨隧道內(nèi)的滲血稀釋作用，從而保證了成分的存留，顯著促進了腱-骨愈合過程。翟文亮等[11]將血小板血漿復合于DPB，該復合物也可顯著促進腱-骨愈合。本實驗將OPG與DPB制成復合物，結(jié)果亦顯著促進ACL重建術(shù)后的腱-骨愈合。

綜上所述，本研究證實了OPG/DPB復合物可顯著促進了ACL重建術(shù)后的腱-骨早期愈合，為今后的臨床應用提供了的理論基礎。