負(fù)載姜黃素支架體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的可行性研究

KANG BO KYOUNG 陳維明 周廣東 曹德君

外傷、腫瘤、炎癥等造成的軟骨病變和缺損臨床較為常見，且軟骨無血管神經(jīng)，損傷后極難自我修復(fù)[1]，嚴(yán)重影響患者的身心健康。目前，軟骨缺損可通過軟骨組織移植、軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞移植、生物材料填充等方法進行修復(fù)重建[2]，但這些方法均存在一定的局限性，如自體軟骨來源有限，異體軟骨排斥反應(yīng)，人工材料外露等。因此，軟骨缺損修復(fù)和功能重建仍是外科治療的難題[2]。近年來，快速發(fā)展的組織工程技術(shù)為解決上述難題提供了新的方向。組織工程技術(shù)主要包括種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子等要素。自體軟骨細(xì)胞是目前軟骨再生的重要種子細(xì)胞來源，但由于自體軟骨細(xì)胞來源有限，取材創(chuàng)傷大，體外擴增后易老化和去分化，喪失軟骨再生能力，很難在臨床上推廣應(yīng)用。

因此，增殖能力強又具有多向分化潛能的干細(xì)胞成為研究熱點。BMSC具有取材方便、創(chuàng)傷相對小、可重復(fù)取材、增殖能力旺盛、軟骨再生能力強等優(yōu)勢，使其成為軟骨再生的理想種子細(xì)胞[3-4]。但BMSC體外構(gòu)建的軟骨在皮下環(huán)境易發(fā)生骨化，最終導(dǎo)致軟骨再生失敗[5]。我們的前期研究證實，軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后可形成穩(wěn)定的軟骨，很少骨化，主要是因為軟骨細(xì)胞本身可以分泌血管抑制因子[6]。但是，利用BMSC體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后，很容易發(fā)生血管侵入和基質(zhì)鈣鹽沉積，不能形成穩(wěn)定的軟骨組織。因此，BMSC再生軟骨皮下異位骨化很可能與抗血管化因子不足以抵抗皮下環(huán)境中的促血管化因子有關(guān)。因此，尋找對抗促血管化因素的方法，可能是克服BMSC體外構(gòu)建軟骨異位骨化的關(guān)鍵[7-9]。

姜黃素具有抗腫瘤血管生成的作用[10]，主要是通過作用于血管內(nèi)皮生長因子及其受體而抑制血管的生成。研究表明，姜黃素可明顯抑制艾氏腹水癌細(xì)胞在荷瘤小鼠體內(nèi)形成的實體腫瘤的血管形成，說明姜黃素是一種特異性血管生成抑制劑[10-16]。因此，本研究擬探討負(fù)載姜黃素的支架材料能否通過抑制血管化而調(diào)控軟骨再生，希望為BMSC構(gòu)建軟骨組織的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔5只(甲干生物有限公司)，雌雄不限，體質(zhì)量4～5 Kg；BALB/c裸鼠(中科院動物所)30只，雌雄不限。上海白山羊 1只(甲干生物有限公司)。

1.2 實驗材料

姜黃素(百靈威科技有限公司)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，hUVEC)(上海歌凡生物科技有限公司)，低糖 DMEM 培養(yǎng)基、高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液(Hyclone，美國)，青霉素、鏈霉素混合液(Gibco，美國)，Ⅱ型膠原酶(Gibco，美國)，明膠 (阿拉丁試劑有限公司)。

1.3 細(xì)胞來源與擴增

1.3.1hUVEC

鏡下觀察hUVEC生長情況，當(dāng)細(xì)胞融匯至80%左右，置于37 ℃培養(yǎng)箱預(yù)溫3 h后，0.05%胰酶-EDTA消化傳代。1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞。更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含15% FBS的低糖DMEM，按1∶3分裝至3個培養(yǎng)皿中， 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿底面80%～85%時使用。

1.3.2羊BMSC

無菌抽取羊的髂骨骨髓，加入骨髓體積1∶1～2∶1的無血清培養(yǎng)基。1 800 r/min離心8 min，棄去1/2的培養(yǎng)液，再加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)基15～30 mL。1 800 r/min 離心8 min，棄去2/3的培養(yǎng)基。移入新的離心管，加入含15%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×108cells/L，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。原代培養(yǎng)72 h后首次半量換液，以后每3天換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿底面80%～85%時，0.05%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。1 500 r/min離心8 min，再加入含15% FBS的低糖DMEM，按1∶3分裝至3個培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。本實驗所用細(xì)胞均為第2代BMSC。

1.3.3兔耳軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無菌剪取單側(cè)兔耳上1/3，去除周圍的軟組織，將耳軟骨切成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入5倍體積的0.25% Ⅱ型膠原酶，搖床消化過夜；75 μm孔徑濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，PBS漂洗2遍，以含10%FBS的高糖DMEM配制成細(xì)胞懸液，按2×106個/皿(直徑10 cm培養(yǎng)皿)接種細(xì)胞，置入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞達90%融合時進行傳代。本實驗所用細(xì)胞均為第2代軟骨細(xì)胞[1]。

1.4 姜黃素儲備液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品配制：姜黃素分子量為368.38 g/mol。將姜黃素溶解于完全避光的DMSO中，配制成濃度10 mmol/L的姜黃素儲備液，此液體可在4 ℃下保存2周。進行測試時，需要配置不同濃度的應(yīng)用液,以姜黃素儲備液進行稀釋, 現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 不同濃度的姜黃素溶液與細(xì)胞劃痕實驗

按照姜黃素分子量配制3個不同濃度的姜黃素溶液：30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L；6孔板上接種hUVEC，細(xì)胞濃度均為2×105cells/mL(n=3)；另一6孔板接種BMSC，細(xì)胞濃度均為2×105cells/mL(n=3)；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，細(xì)胞必須長滿(100%)；待細(xì)胞長滿后，用槍頭比著直尺(高壓滅菌的鋼尺)，垂至于背后的橫線劃痕，劃1道(槍頭必須要垂直，不能傾斜)；用PBS洗1～2次，去除劃下的細(xì)胞；對照組孔里加無血清培養(yǎng)基，實驗組孔里加不同濃度的姜黃素溶液；0 h、6 h、12 h、24 h和48 h后取樣本拍照，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.6 負(fù)載姜黃素支架材料的制備

將1.5 g明膠置入含有100 mL去離子水中，60 ℃水浴加熱，不斷攪拌至明膠溶解；將溶解的明膠溶液倒入48孔板中，放入-20 ℃冰箱冷凍24 h，再放入真空冷凍干燥箱中48 h，將樣品完全干燥；將0.5 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和0.3 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解于95%乙醇中，配置EDC/NHS化學(xué)交聯(lián)液；將支架放入上述交聯(lián)液中交聯(lián)12 h；然后用去離子水多次沖洗，去除交聯(lián)劑，得到明膠支架，設(shè)為對照組；配置姜黃素溶液：將2 mg姜黃素溶于無水乙醇中(含5%冰醋酸)，將明膠支架置于姜黃素溶液中2 h，去離子水沖洗，得到負(fù)載姜黃素支架，設(shè)為實驗組。將兩組支架再次放入-20 ℃的冰箱中冷凍24 h、真空冷凍干燥箱中干燥48 h至樣品完全干燥。將支架材料切成直徑9 mm、厚度約 2 mm的圓片備用。

1.7 掃描電鏡觀察

將明膠支架(對照組)和負(fù)載姜黃素支架(實驗組)用剪刀剪切成小片(半圓形，直徑5 mm)，導(dǎo)電膠固定，噴金，黏托，掃描電鏡觀察兩組材料的微觀結(jié)構(gòu)[2]。每個試樣取3個平行樣品。

1.8 細(xì)胞-材料復(fù)合物的制備

將直徑9 mm、厚度約2 mm的圓片(對照組為明膠支架，實驗組為負(fù)載姜黃素支架)在真空冷凍干燥機進行過夜冷凍干燥滅菌處理，再紫外線照射15 min(波長240 nm，能量30 W)；將第 2代軟骨細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液制備成5×107cells/mL濃度的細(xì)胞懸液；兩組材料各加入130 μL細(xì)胞懸液，然后將構(gòu)建的細(xì)胞-材料復(fù)合物放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后慢慢加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液覆蓋復(fù)合物，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。體外培養(yǎng)1周后，將復(fù)合物植入裸鼠皮下。

1.9 組織學(xué)檢測

1.9.1單純材料支架

將負(fù)載姜黃素支架材料與明膠支架分別植入裸鼠皮下，3、6周后取材，行組織學(xué)檢測(HE、番紅O-固綠染色)。

1.9.2細(xì)胞-材料復(fù)合物

兩組細(xì)胞-材料復(fù)合物體外培養(yǎng)1周后，分別植入BALB/c裸鼠背部皮下左右兩側(cè)。3、6周后取出，行HE、番紅O-固綠、Ⅱ型膠原免疫組化檢測。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

2.1.1hUVEC

細(xì)胞貼壁第1天，達到80%～85%融合，hUVEC均呈典型的漩渦狀生長，細(xì)胞呈多角形、短粗的梭形，細(xì)胞增殖力和活力佳(圖1)。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(標(biāo)尺：50 μm)

2.1.2BMSC

原代BMSC貼壁后第5天，慢慢開始出現(xiàn)克隆性增長表現(xiàn)。在顯微鏡下觀察到透亮的貼壁和未貼壁的細(xì)胞，傳代后，高倍鏡下可見BMSC大多呈梭形或者多角形(圖2)。

圖2 第1代羊BMSC(標(biāo)尺：50 μm)

2.2 細(xì)胞劃痕實驗

hUVEC細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示：姜黃素濃度為30 μmol/L，12 h開始出現(xiàn)hUVEC細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。BMSC細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示：姜黃素濃度在40 μmol/L以下時，未觀察到BMSC出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。說明姜黃素濃度在40 μmol/L以下不會影響B(tài)MSC的生長。

因此，姜黃素的最佳濃度范圍為30～40 μmol/L，既可抑制hUVEC生長又不影響B(tài)MSC增殖(圖3、4)。

圖4 BMSC細(xì)胞劃痕實驗(標(biāo)尺：100 μm)

2.3 支架材料大體觀察、掃描電鏡觀察

大體觀察顯示，對照組呈白色，實驗組呈黃色，此外兩組并無明顯不同。掃描電鏡觀察顯示，兩組支架材料均分布均勻，具有一定孔隙率，無顆粒狀物質(zhì)附著(圖5)。

2.5 支架材料皮下植入后大體觀察

對照組和實驗組支架材料皮下植入3、6周后，大體觀察顯示，對照組有明顯的血管化現(xiàn)象，而實驗組周圍血管化受到明顯抑制，提示姜黃素具有明顯的血管抑制作用(圖6)。

圖6 支架材料皮下植入后大體觀察

2.6 支架材料皮下植入后組織學(xué)觀察

體內(nèi)培養(yǎng)3周后取材，HE、番紅-固綠染色顯示，兩組樣本均有部分被吸收，對照組可觀察到明顯的血管分布，實驗組未觀察到明顯的血管分布。體內(nèi)培養(yǎng)6周后取材，對照組被吸收的程度比實驗組更明顯，實驗組未觀察到明顯血管分布(圖7、8)。

圖7 支架材料皮下植入3周后組織學(xué)觀察(標(biāo)尺：500 μm)

圖8 支架材料皮下植入6周后組織學(xué)觀察(標(biāo)尺：500 μm)

2.7 細(xì)胞-材料復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建的大體觀察

大體觀察顯示對照組有大部分區(qū)域呈現(xiàn)明顯的紅色外觀，實驗組呈瓷白色的軟骨樣外觀，未見明顯紅色樣改變。實驗組和對照組外觀均一，未見明顯的大小變化(圖9)。

2.8 細(xì)胞-材料復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建的組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察顯示，細(xì)胞-材料復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建3、6周，兩組細(xì)胞-材料復(fù)合物均有軟骨陷窩形成。體內(nèi)培養(yǎng)3周，實驗組軟骨陷窩形成較對照組更為明顯(圖10)；體內(nèi)培養(yǎng)6周，兩組均有成熟的軟骨陷窩形成，兩組未見明顯差異，提示負(fù)載姜黃素未對皮下環(huán)境的軟骨再生產(chǎn)生明顯的不良影響(圖11)。

圖10 細(xì)胞-材料復(fù)合物皮下植入3周后組織學(xué)觀察(標(biāo)尺：500 μm)

圖11 細(xì)胞-材料復(fù)合物皮下植入6周后組織學(xué)觀察(標(biāo)尺：200 μm)

3 討論

目前BMSC體外構(gòu)建軟骨在皮下環(huán)境中異位骨化是公認(rèn)的難題，一般認(rèn)為異位骨化主要與血管化有關(guān)，因此解決該難題的關(guān)鍵就是抑制血管化。姜黃素具有抗腫瘤血管生成作用，可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子及其受體而抑制荷瘤小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞形成的實體腫瘤的血管形成，說明姜黃素是一種特異性血管生成抑制劑[10-16]。

使用軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建的軟骨樣組織植入皮下后可以形成穩(wěn)定的軟骨，很少發(fā)生骨化，但是利用BMSC體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后卻很容易發(fā)生血管侵入和基質(zhì)鈣鹽沉積，不能形成穩(wěn)定的軟骨組織。皮下環(huán)境不利于BMSC誘導(dǎo)的軟骨生長，而且單純BMSC誘導(dǎo)的軟骨植入皮下后產(chǎn)生的抗血管化因子不足以抵抗皮下環(huán)境中的促血管化因子，造成失衡。

本研究設(shè)置不同濃度的姜黃素溶液，細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，姜黃素濃度為30 μmol/L時，12 h即出現(xiàn)hUVEC細(xì)胞凋亡，而姜黃素濃度在40 μmol/L以下時未觀察到BMSC細(xì)胞凋亡，說明姜黃素合適的濃度范圍為30～40 μmol/L，是既可抑制hUVEC生長又不影響B(tài)MSC增殖的最佳濃度范圍。

對照組和實驗組材料分別植入裸鼠皮下后，結(jié)果顯示，兩組支架材料分布比較均勻，具有一定孔隙率，無顆粒狀物質(zhì)附著。這說明姜黃素能夠很好地溶解于明膠材料中，并未存留不溶物，且不影響明膠材料的微觀結(jié)構(gòu)。組織學(xué)觀察顯示實驗組呈現(xiàn)了明顯的血管抑制現(xiàn)象。這對于后期進一步研究姜黃素通過抑制血管化來調(diào)控干細(xì)胞的異位骨化至關(guān)重要。

另外，組織學(xué)觀察顯示，體內(nèi)植入3周、6周后，兩組細(xì)胞-材料復(fù)合物均有軟骨陷窩形成，未見明顯差異，提示負(fù)載姜黃素后未對皮下環(huán)境的軟骨再生產(chǎn)生明顯的不良影響。

本研究表明，抗血管化藥物姜黃素對軟骨細(xì)胞生長無害，不引起炎癥反應(yīng)，對軟骨細(xì)胞無明顯破壞。本研究結(jié)果對于今后應(yīng)用姜黃素參與以BMSC為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨提供了依據(jù)。