3D打印骨科鈦合金的亞慢性全身毒性研究

王涵 趙丹妹 許建霞 連環(huán) 曲明悅 何牧野 王春仁

3D打印技術(shù)又稱為增材制造技術(shù)或快速成型技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域。就鈦合金植入物而言，目前我國已有3D打印鈦合金植入物獲得CFDA的注冊許可證，更多的增材制造醫(yī)用鈦合金植入物也逐步進(jìn)入醫(yī)療器械注冊審評環(huán)節(jié)[1]。

3D打印骨科植入物作為長期植入體內(nèi)的醫(yī)療器械產(chǎn)品，存在體液環(huán)境中微粒析出、動態(tài)環(huán)境中材料脫落等風(fēng)險，對其進(jìn)行合理的臨床前安全性評價很重要[2]。本研究對3D打印的骨科鈦合金的亞慢性全身毒性進(jìn)行研究，以判斷其是否具有潛在的亞慢性全身毒性，為相關(guān)的臨床研究和應(yīng)用提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠，4～5周齡(中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源中心)，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后用于實(shí)驗(yàn)。大鼠獨(dú)立通氣籠(IVC)條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)密度2只/籠，換氣次數(shù)大于50次，籠盒內(nèi)風(fēng)速小于0.2 m/s，室溫20 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%。光照采用自動定時方式控制12 h光照12 h黑暗。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京) 2014-0013；實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(京) 2017-0013；飼料生產(chǎn)許可證號：京飼證(2014)06054。

1.1.2試劑與儀器

生化檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；凝血酶原時間PT檢測試劑盒、活化部分凝血活酶時間APTT檢測試劑盒、血液學(xué)檢測試劑盒(希森美康醫(yī)用電子有限公司，日本)；水合氯醛、檸檬酸三鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液、甲醛(石家莊四藥股份有限公司)。

HITACHI 7080全自動生化分析儀、低溫離心機(jī)(日立公司，日本)，Sysmex CA 1500全自動凝血分析儀、Sysmex XT-1800i全自動血液分析儀(希森美康醫(yī)用電子有限公司，日本)，顯微鏡(萊卡公司，德國)，電子天平(上海躍平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1試驗(yàn)樣品

3D打印骨科鈦合金試樣(國產(chǎn)；規(guī)格：6×10×30)，輻照滅菌。

1.2.2樣品浸提液制備

采用0.9%NaCl注射液按0.2 g/mL比例制備浸提液，在37 ℃下振搖浸提72 h。用同批號浸提介質(zhì)作為陰性對照。

1.2.3試驗(yàn)步驟

注射前隨機(jī)將大鼠分為對照組和試驗(yàn)組，每組20只，雌雄各半。試驗(yàn)組大鼠尾靜脈注射檢測樣品浸提液，對照組大鼠尾靜脈注射浸提介質(zhì)，每天注射1次，注射量為10 mL/Kg，共注射28 d。根據(jù)大鼠體重增長情況調(diào)整檢測樣品浸提液注射體積。28 d后解剖，解剖前禁食16 h，稱取空腹體質(zhì)量，10%水合氯醛溶液以0.4 mL/100 g BW大鼠腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血，分別測定血液學(xué)、血液生化學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)；放血處死大鼠，解剖觀察各組織器官是否出現(xiàn)異常，稱取各臟器濕重值，計(jì)算各組織器官的臟器系數(shù)(g/100 g)，浸泡在10%甲醛溶液固定后進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。

1.2.4檢測指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束日，麻醉后下腔靜脈取血。測定血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血小板數(shù)(PLT)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)和凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)等血液學(xué)指標(biāo)；血液經(jīng)離心分離血清，測定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、肌酐(CRE)、總膽固醇(T-CHO)等臨床生化指標(biāo)。大鼠處死后系統(tǒng)尸解，稱取腦、心、肝、脾、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢的質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)(g/100 g)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若兩組樣本方差齊性且符合正態(tài)分布，選擇兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若方差不齊選用兩樣本秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況觀察

對照組和樣品組大鼠外觀及行為正常，活動自如，呼吸均勻，心跳勻速，反應(yīng)敏捷，被毛潤澤，皮膚和黏膜無改變，眼、耳、鼻、口、生殖腺和肛門無異常分泌物，糞便軟、色棕黃、成型。每日觀察未見大鼠出現(xiàn)明顯異常反應(yīng)或?yàn)l死狀態(tài)。

2.2 對體質(zhì)量的影響

各時間點(diǎn)樣品組與對照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 大鼠體質(zhì)量

2.3 血細(xì)胞

雄性大鼠樣品組淋巴細(xì)胞數(shù)(L)與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；其余各指標(biāo)雌雄樣品組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 大鼠血液學(xué)數(shù)據(jù)

*：與同性別對照組比較，P<0.05

*: Compared with the control group of the same sex,P<0.05

2.4 臨床生化

雄性大鼠樣品組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、肌酐(CRE)與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；雌性大鼠樣品組甘油三酯(TG)與同性別對照組差異顯著(P<0.05)；其余各指標(biāo)雌雄大鼠樣品組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 大鼠血生化數(shù)據(jù)

*：與同性別對照組比較，P<0.05

*: Compared with the control group of the same sex,P<0.05

2.5 大鼠解剖觀察

解剖過程中未發(fā)現(xiàn)與試驗(yàn)材料相關(guān)的肉眼可見的器官組織病變。

2.6 對臟器濕重的影響

雄性大鼠脾及腎上腺臟器質(zhì)量與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；其余臟器雌雄大鼠樣品組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 大鼠臟器濕重?cái)?shù)據(jù)

2.7 對臟器系數(shù)的影響

雄性大鼠腎上腺臟器系數(shù)值與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；其余指標(biāo)雌雄大鼠樣品組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

表5 大鼠臟器系數(shù)數(shù)據(jù)

*：與同性別對照組比較，P<0.05

*: Compared with the control group of the same sex,P<0.05

2.8 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

對照組及樣品組個別動物出現(xiàn)了輕度肝細(xì)胞脂肪變性、肺輕度間質(zhì)炎癥、輕度慢性間質(zhì)性腎炎，其余各組織臟器未見明顯異常。兩組均有個別動物出現(xiàn)上述病變，不考慮為樣品的毒性反應(yīng)。

3 結(jié)論

SD大鼠靜脈注射樣品浸提液28 d后，經(jīng)各項(xiàng)指標(biāo)檢測，與浸提介質(zhì)對照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但無臨床意義的指標(biāo)如下：

①雄性大鼠樣品組淋巴細(xì)胞數(shù)(L)與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。但這些值均在本實(shí)驗(yàn)室參考值范圍內(nèi)，不考慮為毒性反應(yīng)。

②雄性大鼠樣品組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、肌酐(CRE)與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；雌性大鼠樣品組甘油三酯(TG)與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。但這些值均在本實(shí)驗(yàn)室參考值范圍內(nèi)，不考慮為毒性反應(yīng)。

③雄性大鼠脾及腎上腺臟器質(zhì)量與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，雄性大鼠腎上腺臟器系數(shù)值與同性別對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。但這些值均在本實(shí)驗(yàn)室參考值范圍內(nèi)，不考慮為毒性反應(yīng)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測樣品未顯示出具有臨床意義的異常指標(biāo)或毒性靶器官。

4 討論

3D打印骨科鈦合金植入物作為長期植入體內(nèi)的醫(yī)療器械產(chǎn)品，除其治療的精準(zhǔn)性、有效性之外，其安全性同樣值得關(guān)注。目前，我們進(jìn)行3D打印植入物的生物相容性評價時，還是按照GB/T 16886系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。本研究通過SD大鼠尾靜脈注射途徑進(jìn)行了3D打印骨科鈦合金的亞慢性毒性試驗(yàn)。本試驗(yàn)中樣品浸提介質(zhì)為生理鹽水，連續(xù)給樣時間為28 d，通過對大鼠體質(zhì)量、血液學(xué)、臨床生化、臟器系數(shù)、組織病理學(xué)檢測等指標(biāo)綜合分析，未檢測到該樣品的亞慢性全身毒性。但本試驗(yàn)中只檢測了試驗(yàn)樣品生理鹽水(極性介質(zhì))浸提液，還可參照ISO 10993.11-2017中的胃腸外雙途徑接觸試驗(yàn)方法，綜合評價該樣品極性及非極性可瀝濾物同時接觸人體時產(chǎn)生重復(fù)接觸全身毒性的可能性。

對3D打印醫(yī)療器械來說，需從數(shù)據(jù)和軟件、原材料、工藝穩(wěn)定性等方面進(jìn)行控制及標(biāo)準(zhǔn)化，以實(shí)現(xiàn)對其全過程的控制，才能確保最終的產(chǎn)品質(zhì)量[3-4]。FDA關(guān)于增材制造的指導(dǎo)原則《Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff》于2017年12月發(fā)布[5]，目前國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心已制定《定制式增材制造醫(yī)療器械注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，其他增材制造相關(guān)的醫(yī)療器械注冊審查指導(dǎo)原則也在陸續(xù)編寫過程中。