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    超聲-閃式聯(lián)合法制備藍(lán)莓花色苷提取物及其 體內(nèi)外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

    2020-04-02 03:32:58薛宏坤譚佳琪劉成海
    食品科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:小鼠

    薛宏坤,譚佳琪,劉成海,劉 釵,

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    藍(lán)莓中富含花色苷、多酚和黃酮等活性成分,具有較高的醫(yī)學(xué)和藥用價(jià)值,市場(chǎng)認(rèn)知度高、需求量大,已被廣泛用于食品、藥品和保健品領(lǐng)域中[1]。其中花色苷屬于一種水溶性的天然色素,安全無(wú)毒。研究表明花色苷具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、抗腫瘤和增強(qiáng)視力等 功效[2]。因此,如何高效地從藍(lán)莓中提取花色苷已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

    目前,對(duì)花色苷的提取主要采用傳統(tǒng)的溶劑提取,該方法操作簡(jiǎn)單,但耗時(shí)長(zhǎng),溶劑消耗量大,提取效率低,無(wú)法滿足當(dāng)前需求[3]。隨著提取技術(shù)的發(fā)展,各種先進(jìn)的提取技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,如微波提取[4]、超聲提取[5]、超臨界提取[6]和酶法提取[7]等技術(shù)已經(jīng)用于花色苷的提取中,其中微波提取具有加熱速度快,效率高等特點(diǎn),但由于萃取液內(nèi)物料的極性不同,吸收和轉(zhuǎn)化微波能的能力不同,造成萃取液溫度分布不均,局部高溫造成熱敏性成分的降解,使之失去原有的生理活性[8]。超臨界提取對(duì)提取設(shè)備要求較高,價(jià)格昂貴。酶法提取條件溫和,但對(duì)pH值變化較敏感。超聲提取是利用其空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)加速植物細(xì)胞壁破裂,降低細(xì)胞內(nèi)活性成分傳質(zhì)阻力,提高傳質(zhì)系數(shù),使細(xì)胞內(nèi)的活性成分更容易從細(xì)胞中擴(kuò)散到周圍溶劑中,從而提高效率[9]。另一種閃式提取法也是活性成分提取最常用的方法之一,其主要原理是通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)的刀頭將植物組織細(xì)化成顆粒,并通過(guò)剪切效應(yīng)、負(fù)壓滲濾和溶劑萃取等效應(yīng)將植物細(xì)胞中的活性成分快速溶出,從而提高效率[10]。這兩種方法均具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單和過(guò)程易控制等特點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于活性成分的提取中。目前,對(duì)于兩者聯(lián)合使用提取藍(lán)莓花色苷的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。關(guān)于提取后所得的花色苷的研究主要集中在對(duì)其進(jìn)行分離純化、抗氧化活性等方面。而花色苷在抗腫瘤活性方面的作用也逐漸成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn),但對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制尚無(wú)定論。

    鑒于此,本研究采用超聲-閃式聯(lián)合提取法提取藍(lán)莓花色苷,通過(guò)單因素試驗(yàn)探究超聲功率、閃提轉(zhuǎn)速、提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響,并分析不同萃取條件下花色苷的萃取特性;在此基礎(chǔ)上,通過(guò)遺傳算法優(yōu)化花色苷提取工藝參數(shù);采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探究花色苷提取物的抗腫瘤活性,并對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行探討。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    BABL/c小鼠40 只,雌雄各半,6 周齡,體質(zhì)量182 g,SPF級(jí),由哈爾濱腫瘤醫(yī)院提供,許可證號(hào)為SCXK(黑)2006008。S180小鼠腹水瘤細(xì)胞由哈爾濱腫瘤醫(yī)院提供,由昆明種小鼠腹腔積液傳代。

    半高叢藍(lán)莓 黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院;無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇(均為分析純) 天津 市富宇精細(xì)化工有限公司;MTT、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS) 北京索萊寶科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 上海萊昂生物科技有限公司;注射用環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;RPMI 1640和胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;胰蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒 碧云 天生物技術(shù)研究所;小鼠IL-12、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DK-98-IIA型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;LAMBDA35型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司;TD-50凍干機(jī) 上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LN12-JHBE50T閃式提取器 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;DS-3510DTH超聲波清洗器 上海奧析科學(xué)儀器有限公司;超聲-閃式聯(lián)合提取裝置為超聲波清洗器與閃式提取器組合改裝而成;MultiskanMk3型酶標(biāo)儀、ST16R冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Forma公司;TS100倒置熒光顯微鏡 日本Nikon 公司;Attune NxT流式細(xì)胞儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;BSC-20超凈工作臺(tái) 沈陽(yáng)寶創(chuàng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;J-SG微量移液器 北京川布蘭科技發(fā)展有限公司;HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;PRACTUM224-1CN分析天平 德國(guó)賽多利斯儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品前處理

    實(shí)驗(yàn)前將冷凍的藍(lán)莓從冰箱中取出,室溫解凍3 h,打漿,將果漿置于玻璃皿中,放在-18 ℃冰箱中冷凍12 h,然后置于真空冷凍干燥機(jī)凍至24 h,取出用植物粉粹機(jī)將其粉碎,過(guò)40 目篩,制成果粉,避光密封在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 藍(lán)莓花色苷提取物(blueberry anthocyanins extracts,BAE)的制備

    取5 g藍(lán)莓果粉于提取容器中,按照1∶30(g/mL)的料液比加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液將其充分溶解,然后將提取容器置于超聲-閃式聯(lián)合提取裝置中,設(shè)定閃提轉(zhuǎn)速8 000 r/min,超聲功率350 W,提取時(shí)間10 min,提取結(jié)束后,將提取液置于離心機(jī)中以6 000 r/min離心15 min,將上清液收集于玻璃瓶中。向?yàn)V渣中再加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液,操作同上,提取2 次,合并3 次提取液。將其用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃減壓蒸發(fā)濃縮至浸膏質(zhì)量不再發(fā)生變化,所得浸膏即為BAE,最后將其置于離心管中,放入4 ℃冰箱備用。

    1.3.3 花色苷含量的測(cè)定

    采用pH示差法測(cè)定不同提取條件下提取物中花色苷含量,參考于澤源等[11]的方法并略做改動(dòng)。取1 mL樣品(BAE),分別加入9 mL pH 1.0氯化鉀緩沖液和9 mL pH 4.5乙酸鈉緩沖液,將其充分混合,避光靜止1 h,分別在520 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,分別依據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算提取物中花色苷含量和純度。

    式中:c為提取物中花色苷含量/(mg/g);A為樣品提取液的吸光度;DF為稀釋倍數(shù);mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(449.2);ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26 900);m為藍(lán)莓果粉的質(zhì)量/g;V為萃取液體積/mL;P為藍(lán)莓花色苷純度/%。

    1.3.4 單因素試驗(yàn)

    在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇乙醇為提取溶劑,超聲-閃式聯(lián)合法為提取藍(lán)莓花色苷的方法,操作同1.3.2節(jié)。以5 g藍(lán)莓粉為提取對(duì)象,對(duì)超聲功率、閃提轉(zhuǎn)速、提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),討論各因素對(duì)花色苷含量的影響。其中超聲功率設(shè)300、350、400*、450、500 W 5 個(gè)水平;閃提轉(zhuǎn)速設(shè)6 000、7 000、8 000*、9 000、10 000 r/min 5 個(gè)水平;提取時(shí)間設(shè)6、8、10*、12、14 min 5 個(gè)水平;料液比設(shè)1∶10、1∶20、1∶30*、1∶40、1∶50(g/mL)5 個(gè)水平;乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)40%、50%、60%*、70%、80% 5 個(gè)水平。結(jié)果均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得的平均值。*表示當(dāng)考察其他因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量影響時(shí),用*標(biāo)記的因素保持恒定水平。

    1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以超聲功率(X1)、閃提轉(zhuǎn)速(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)為自變量,以花色苷含量(Y)為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

    表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded and actual levels of factors

    采用響應(yīng)面分析法得到的二次回歸模型如式(3)所示:

    式中:b0為截距回歸系數(shù);bi為線性回歸系數(shù);bii為二次項(xiàng)的回歸系數(shù);bij為交互項(xiàng)的回歸系數(shù);Xi、Xj為自變量。

    1.3.6 超聲提取、閃式提取和傳統(tǒng)溶劑提取法提取藍(lán)莓花色苷

    超聲提取法條件設(shè)定為:超聲功率400 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30(g/mL)、提取時(shí)間10 min;閃式提取法條件設(shè)定為:轉(zhuǎn)速8 000 r/min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30(g/mL)、提取時(shí)間10 min;傳統(tǒng)溶劑提取條件設(shè)定為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比 1∶30(g/mL)、提取時(shí)間50 min,將上述3 種提取方式得到的花色苷含量與超聲-閃式聯(lián)合法(超聲功率400 W、轉(zhuǎn)速8 000 r/min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比 1∶30(g/mL)、提取時(shí)間10 min)進(jìn)行對(duì)比,根據(jù)藍(lán)莓花色苷含量判定提取方式的優(yōu)劣。

    1.3.7 遺傳算法設(shè)計(jì)

    在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上,選取超聲功率、閃提轉(zhuǎn)速和乙醇體積分?jǐn)?shù)3 個(gè)因素為決策變量。即:

    優(yōu)化的約束條件:依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇各因素水平的上下限,花色苷含量?jī)?yōu)化約束條件如下式所示:

    1.3.8 BAE抗腫瘤活性體外實(shí)驗(yàn)

    1.3.8.1 MTT法檢測(cè)S180細(xì)胞的增殖

    在上述最優(yōu)參數(shù)組合下得到的BAE,參照劉燕琳等[12]的方法溶解于RPMI 1640培養(yǎng)基中,將BAE配制成質(zhì)量濃度為(200、400、600、800、1 000 μg/mL)樣品溶液,溶液過(guò)0.22 μm濾膜,經(jīng)除菌置于-20 ℃冰箱中保存。

    S180細(xì)胞培養(yǎng)于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.0%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,然后置于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2和90%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)期的S180細(xì)胞按1×105個(gè)/mL的密度分別接種于96 孔培養(yǎng)板,貼壁培養(yǎng)24 h。棄去上清液,用PBS清洗3 次,分別準(zhǔn)確移取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品加入到每孔中,陰性對(duì)照組用等量的完全培養(yǎng)基取代,48 h后,棄上清液,加入100 μL 1.0 g/L MTT孵育4 h,吸出MTT,加入DMSO,搖床低速振5 min,490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。依據(jù)式(8)計(jì)算BAE對(duì)S180細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率:

    式中:A0為陰性對(duì)照組的吸光度;A1為給藥組的吸光度。

    1.3.8.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)S180細(xì)胞的凋亡率及周期分布

    S180細(xì)胞經(jīng)過(guò)BAE樣品(質(zhì)量濃度0(空白組)、200、400、600、800、1 000 μg/mL),處理48 h后,使用Annexin V-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)S180細(xì)胞的凋亡及周期分布。檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

    1.3.9 BAE抗腫瘤活性體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

    1.3.9.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

    采用隨機(jī)數(shù)字法,將40 只BABL/c小鼠分為5 組,每組8 只,雌雄各半,其分組為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組。

    1.3.9.2 造模方法

    將S180瘤株接種在昆明種小鼠的腹腔中,接種7 d后,選擇腹腔積液飽滿的荷瘤小鼠頸椎法將其處死,抽取乳白色的腹腔積液,然后將其稀釋成單細(xì)胞懸液,檢測(cè)活細(xì)胞數(shù),成活率大于95%方可接種。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL,在模型對(duì)照組、BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組每只BABL/c小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL,空白對(duì)照不接種,建立S180荷肉瘤小鼠模型。

    1.3.9.3 給藥方式

    實(shí)驗(yàn)接種第2天開(kāi)始,每天上午腹腔注射給藥,其中BAE低、中、高劑量組分別給予BAE100、200、 400 mg/(kg·d),空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予同體積的生理鹽水,給藥12 d,末次給藥24 h后,摘除眼球取血,離心取上清液。脫頸椎處死小鼠,剝離腫瘤,稱質(zhì)量,依據(jù)式(9)計(jì)算抑瘤率:

    按照馬新博等[13]操作方法,采用ELISA法檢測(cè)S180荷瘤小鼠血清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對(duì)比不同提取方式對(duì)藍(lán)莓花色苷含量和純度的影響

    圖 1 提取方式對(duì)藍(lán)莓花色苷含量和純度的影響Fig. 1 Effects of extraction methods on the yield and purity of anthocyanins

    由圖1可知,4 種提取方式(超聲-閃式聯(lián)合法提取、超聲提取、閃式提取和傳統(tǒng)溶劑提取法)對(duì)藍(lán)莓花色苷純度無(wú)顯著影響(P>0.05)。4 種提取方式下藍(lán)莓花色苷含量分別為(2.28±0.03)、(1.75±0.05)、(1.62±0.04)、(1.03±0.05)mg/g,超聲-閃式聯(lián)合法所得藍(lán)莓花色苷含量較超聲提取、閃式提取和傳統(tǒng)溶劑提取法分別提高了23.25%、28.95%和54.82%,研究結(jié)果表明超聲-閃式聯(lián)合法更適合提取藍(lán)莓花色苷,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該方式對(duì)藍(lán)莓花色苷進(jìn)行提取。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    圖 2 超聲功率(A)、閃提轉(zhuǎn)速(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)對(duì)花色苷含量的影響Fig. 2 Effects of ultrasonic power (A), flash extraction speed (B), extraction time (C), solid-to-liquid ratio (D) and ethanol concentration (E) on the yield of anthocyanins

    由圖2A可知,當(dāng)超聲功率在300~400 W時(shí),隨超聲功率增加花色苷含量顯著增加(P<0.05)。其原因是隨超聲功率增加,超聲所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能力增強(qiáng)[14],造成藍(lán)莓細(xì)胞壁被破壞,使得花色苷由內(nèi)向外的傳質(zhì)阻力顯著降低[15],因此花色苷更容易從藍(lán)莓細(xì)胞中擴(kuò)散到溶劑中,進(jìn)而提高花色苷含量[16]。但當(dāng)超聲功率在400~500 W時(shí),花色苷含量隨超聲功率增加呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)(P<0.05)。這是由于超聲功率過(guò)高,產(chǎn)生的高強(qiáng)度空化作用破壞花色苷結(jié)構(gòu),使得花色苷含量顯著降低[17]。故選擇超聲功率在350、400、450 W 3 個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

    由圖2B可知,當(dāng)閃提轉(zhuǎn)速在6 000~8 000 r/min時(shí),隨閃提轉(zhuǎn)速增加花色苷含量顯著增加(P<0.05),在8 000 r/min 時(shí),花色苷含量達(dá)到最大值(1.95±0.06)mg/g。 其原因是隨閃提轉(zhuǎn)速增加,萃取液中所產(chǎn)生的剪切力顯著增加,較大的剪切力能有效破壞藍(lán)莓細(xì)胞壁[18],從而使藍(lán)莓細(xì)胞中的花色苷更容易擴(kuò)散到溶劑中,因此花色苷含量顯著增加。但當(dāng)閃提轉(zhuǎn)速超過(guò)8 000 r/min 時(shí),花色苷含量隨閃提轉(zhuǎn)速增加呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì) (P<0.05)。該研究結(jié)果與朱興一等[19]采用閃提提取油茶枯餅中茶皂素結(jié)果一致。故選擇閃提轉(zhuǎn)速在7 000、8 000、9 000 r/min 3 個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

    由圖2C可知,提取時(shí)間在10 min前,花色苷含量隨提取時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)(P<0.05),當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)10 min,花色苷含量隨提取時(shí)間無(wú)顯著變化 (P>0.05)。通過(guò)方差分析可知,最佳提取時(shí)間為10 min,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再優(yōu)化提取時(shí)間。高虹等[18]采用超聲-閃式聯(lián)合提取香菇柄麥角甾醇也有類似的結(jié)果。

    由圖2D可知,當(dāng)料液比在1∶10~1∶30(g/mL)時(shí),花色苷含量隨溶劑用量增加而顯著增加(P<0.05),在 1∶30(g/mL)時(shí),花色苷含量達(dá)到最大值(2.13±0.06)mg/g。 其原因是隨萃取液用量的增加,固液濃度梯度增加,濃度梯度作為花色苷傳質(zhì)驅(qū)動(dòng)力,高濃度梯度有利于花色苷由內(nèi)向外擴(kuò)散,使得花色苷含量增加[20]。由于固液界面存在傳質(zhì)極限,當(dāng)萃取液用量繼續(xù)增加,固液界面的濃度差增幅逐漸降低[21],故花色苷含量隨溶劑用量增加無(wú)顯著變化(P>0.05)。通過(guò)方差分析知,最佳料液比為1∶30(g/mL),故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再優(yōu)化料液比。

    由圖2E可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%~60%時(shí),隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加花色苷含量顯著增加(P<0.05),其原因是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,乙醇溶解能力增強(qiáng),促進(jìn)花色苷溶解,同時(shí)擴(kuò)散系數(shù)增加,故花色苷含量增加[22]。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),其極性與花色苷極性相似,依據(jù)相似相容原理,此時(shí)花色苷溶解度最高,故花色苷含量取得最大值(2.28±0.03)mg/g。隨后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加花色苷含量顯著降低(P<0.05),歸因于高體積分?jǐn)?shù)乙醇使醇溶性的雜質(zhì)、色素和親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加,其成分與花色苷競(jìng)爭(zhēng)乙醇-水分子[23-24],使得花色苷溶出量降低,進(jìn)而導(dǎo)致花色苷含量降低。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%、60%、70% 3 個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

    2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

    Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。以花色苷含量(Y)為響應(yīng)值,對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,得到藍(lán)莓花色苷含量對(duì)超聲功率(X1)、閃提轉(zhuǎn)速(X2)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)的數(shù)學(xué)模型如式(10)所示:

    對(duì)式(10)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果如表3所示。

    表 2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

    表 3 花色苷含量的回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

    由表3可知,所得的數(shù)學(xué)模型決定系數(shù)R2=0.980 7,F(xiàn)=9.53,P<0.000 1,表明所得模型極顯著。模型失擬項(xiàng)P=0.437 5>0.05,表明模型失擬項(xiàng)不顯著,通過(guò)以上數(shù)據(jù)說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合充分,可靠性較好,可以較好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。

    圖 3 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on the extraction yield of anthocyanins

    依據(jù)F值大小可以判斷各試驗(yàn)因素對(duì)花色苷含量影響的程度,F(xiàn)值越大,表明該試驗(yàn)因素對(duì)提取效果的影響越顯著。由表3可知,F(xiàn)(X1)=93.63,F(xiàn)(X2)=6.96, F(X3)=113.92,即各試驗(yàn)因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲功率>閃提轉(zhuǎn)速,且乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率對(duì)花色苷含量的影響達(dá)到極顯著的水平。響應(yīng)面的坡度陡峭程度可以反映該因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量影響的強(qiáng)弱,響應(yīng)面相對(duì)平緩,說(shuō)明該因素對(duì)花色苷含量影響作用較小。等高線圖的形狀說(shuō)明試驗(yàn)因素兩兩的交互作用是否顯著,如果等高線形狀是橢圓,則說(shuō)明兩變量的交互作用顯著;若等高線形狀是圓,則說(shuō)明變量的交互作用不顯著[25]。由圖3可知,藍(lán)莓花色苷含量均隨3 個(gè)試驗(yàn)因素水平的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì),存在極大值。由等高線圖可以看出,3 個(gè)試驗(yàn)因素兩兩的交互作用均呈現(xiàn)橢圓,表明因素之間的交互作用均顯著,這與方差分析的結(jié)果一致。等高線隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)高于超聲功率,而超聲功率的變化趨勢(shì)高于閃提轉(zhuǎn)速。綜上可知,對(duì)藍(lán)莓花色苷含量影響因素順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲功率>閃提轉(zhuǎn)速,該結(jié)果也與方差分析的結(jié)果一致。

    2.3.2 超聲-閃式聯(lián)合提取藍(lán)莓花色苷的工藝參數(shù)優(yōu)化

    圖 4 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果Fig. 4 Results of optimization by genetic algorithm

    遺傳算法相關(guān)參數(shù)設(shè)定如下:種群大小設(shè)定為180,變異率設(shè)定為0.2,交叉率設(shè)定為0.85,最大迭代設(shè)定為100,其余參數(shù)均使用系統(tǒng)默認(rèn)值,經(jīng)Matlab 2016軟件中的遺傳算法優(yōu)化工具箱計(jì)算得出,迭代15 次,花色苷含量取得最大值,此時(shí)超聲功率(X1)、閃提轉(zhuǎn)速(X2)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)水平編碼分別為1.00、0.44、0.81,即試驗(yàn)水平分別為450.0 W、8 440.0 r/min、68.1%,在此條件下,所得花色苷含量理論值為2.85 mg/g。遺傳算法M文件運(yùn)行結(jié)果如圖4所示。

    2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    通過(guò)遺傳算法優(yōu)化得到提取花色苷工藝參數(shù)組合為超聲功率450.0 W、閃提轉(zhuǎn)速8 440.0 r/min、乙醇體積分?jǐn)?shù)68.1%,花色苷含量和純度的理論值分別為2.85 mg/g和31.15%。為驗(yàn)證該方法的可靠性,考慮實(shí)際情況,將最佳工藝參數(shù)修正為超聲功率450 W、閃提轉(zhuǎn)速8 400 r/min、 乙醇體積分?jǐn)?shù)6 8%,在此條件下所得花色苷含量和純度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值分別為(2.71±0.08)mg/g和(31.79±0.53)%,兩者理論值和實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差分別為4.91%和2.05%。說(shuō)明模型可以較好地模擬和預(yù)測(cè)藍(lán)莓花色苷含量和純度,進(jìn)一步證明采用遺傳算法優(yōu)化藍(lán)莓花色苷提取工藝參數(shù)可行。

    2.4 不同質(zhì)量濃度BAE對(duì)S180細(xì)胞體外增殖的抑制作用

    圖 5 BAE對(duì)S180細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的劑量效應(yīng)Fig. 5 Inhibitory effect of blueberry anthocyanin extract on growth of S180 cells

    由圖5可知,不同質(zhì)量濃度BAE處理S180細(xì)胞48 h后,S180細(xì)胞的抑制率隨BAE質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)BAE質(zhì)量濃度在200 μg/mL時(shí),對(duì)S180細(xì)胞的抑制率為(18.12±0.86)%;而當(dāng)BAE質(zhì)量濃度在1 000 μg/mL時(shí),對(duì)S180細(xì)胞的抑制率為(40.05±1.33)%,后者較前者對(duì)S180細(xì)胞的抑制率提高了21.93%。結(jié)果表明BAE能顯著抑制S180細(xì)胞增殖,并且BAE質(zhì)量濃度越大,抑制效果越顯著,表現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)。

    2.5 不同質(zhì)量濃度BAE對(duì)S180細(xì)胞凋亡的影響

    目前,大量研究證明BAE具有抗氧化和清除自由基的能力[26],對(duì)癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用,加速癌細(xì)胞的凋亡[27]。因此,本實(shí)驗(yàn)在MTT的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究不同質(zhì)量濃度BAE對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響。由圖6可知,不同濃度BAE(200、400、600、800、1 000 μg/mL)處理48 h后,S180細(xì)胞凋亡率分別為(18.82±0.93)%、(29.75±1.33)%、(42.55±2.01)%、(52.80±1.69)%和(66.25±1.54)%,與對(duì)照組相比,凋亡率分別提高了15.47%、26.40%、39.20%、49.45%和62.90%。結(jié)果表明,花色苷提取物能促進(jìn)S180細(xì)胞凋亡,且質(zhì)量濃度越大,S180細(xì)胞凋亡率越高。Urias-Lugo[28]和Yeh[29]等同樣研究發(fā)現(xiàn)花色苷提取物能顯著提高癌細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)和下調(diào)相關(guān)的凋亡蛋白和凋亡因子,從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

    圖 6 不同質(zhì)量濃度BAE作用48 h后S180細(xì)胞凋亡的影響Fig. 6 Apoptosis rate of cancer cells cultured for 48 h in the presence of blueberry anthocyanin extract at different concentrations

    2.6 不同質(zhì)量濃度BAE對(duì)S180細(xì)胞凋亡周期的影響

    S180細(xì)胞經(jīng)過(guò)BAE樣品(質(zhì)量濃度0(空白組)、200、400、600、800、1 000 μg/mL),處理48 h后,S180細(xì)胞凋亡周期情況如圖7和表4所示。

    圖 7 不同質(zhì)量濃度花色苷提取物對(duì)S180細(xì)胞周期的影響Fig. 7 Effect of blueberry anthocyanin extract at different concentrations on cell cycle of S180 cells

    表 4 BAE作用48 h對(duì)S180細(xì)胞周期的影響Table 4 Effect of blueberry anthocyanin extract on cell cycle of S180 cells at 48 h of culture

    由圖7和表4可知,不同質(zhì)量濃度BAE(200、400、600、800、1 000 μg/mL)作用于S180細(xì)胞48 h,與空白對(duì)照相比,S期細(xì)胞比例分別增加了9.59%、27.71%、36.57%、53.44%和63.87%,而G0/G1期細(xì)胞比例分別降低了11.01%、27.44%、41.33%和41.36%(除BAE質(zhì)量濃度在200 μg/mL)。與空白對(duì)照相比,G0/G1期、S期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明花色苷提取物使S180細(xì)胞主要阻滯于S期。

    2.7 各組S180荷瘤小鼠的抑制效果

    表 5 BAE對(duì)S180荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響Table 5 Effect of blueberry anthocyanin extract on tumor mass of sarcoma 180 tumor-bearing mice

    由表5可知,與模型對(duì)照組相比,BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組S180荷瘤小鼠瘤質(zhì)量分別降低0.34、0.43、0.60 g,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BAE對(duì)S180荷瘤小鼠的腫瘤有抑制作用。BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤率分別為26.36%、33.33%和46.51%,高劑量組對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤率較中劑量組和低劑量組分別提高了13.18%和20.15%,分析數(shù)據(jù)可知BAE質(zhì)量濃度越大,對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤率越高,說(shuō)明BAE對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)有劑量效應(yīng)。

    2.8 各組S180荷瘤小鼠血清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量

    CD+T細(xì)胞分為T(mén)h0、Th1和Th2三個(gè)亞群。Th1具有提高NK、LAK細(xì)胞的毒性,誘導(dǎo)IL-2和g干擾素的產(chǎn)生,促進(jìn)T細(xì)胞生成,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2具有分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子,促進(jìn)B細(xì)胞增殖,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在外界刺激下,Th0可轉(zhuǎn)化成Th1和Th2,Th1/Th2比值漂移與腫瘤形成相關(guān),在惡性腫瘤中Th2占優(yōu)勢(shì)[30-31]。Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫承擔(dān)機(jī)體抗腫瘤免疫。IL-12促進(jìn)Th0向Th1轉(zhuǎn)化,是Th1細(xì)胞免疫的啟動(dòng)者之一,在抗腫瘤免疫中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。Th2分泌合成IL-10,它是重要的負(fù)調(diào)控因子,能有效抑制IL-12的合成。因此本實(shí)驗(yàn)選擇Th1型細(xì)胞因子IL-12和Th2型細(xì)胞因子IL-10作為檢測(cè)指標(biāo),其結(jié)果如表6所示。

    表 6 各組S180荷瘤小鼠血清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量比較Table 6 Comparison of serum levels of IL-12, IL-10 and TNF-α in S180 tumor-bearing mice in control and treatment groups

    由表6可知,模型對(duì)照組小鼠血清中IL-12含量較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05),IL-10含量顯著增加 (P<0.05),結(jié)果表明荷瘤小鼠造模成功。BAE作用荷瘤小鼠后,與模型對(duì)照組對(duì)比,BAE低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠血清中IL-12含量均顯著升高 (P<0.05),而IL-10含量顯著降低(P<0.05),且高劑量組和中劑量組在IL-12和IL-10含量變化幅度顯著高于較低劑量組。分析上述數(shù)據(jù)可知,移植腫瘤后,小鼠的免疫功能受到抑制,打破了Th1/Th2的平衡,Th2占優(yōu)勢(shì),而B(niǎo)AE作用后,IL-12含量顯著增加,進(jìn)一步促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,同時(shí)IL-10含量顯著降低,使得Th2優(yōu)勢(shì)地位被打破,從而使免疫反應(yīng)向Th1漂移。因此,體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)被抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BAE是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,調(diào)節(jié)Th1/Th2漂移而發(fā)揮對(duì)腫瘤作用的抑制,且BAE質(zhì)量濃度越大,抑制作用越強(qiáng)。

    TNF-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生,對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用。由表6可知,模型對(duì)照組、BAE低劑量組和中劑量組小鼠血清中的TNF-α含量均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),而高劑量組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)BAE作用后,與模型對(duì)照組相比,BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠血清中TNF-α含量均顯著升高(P<0.05),且劑量越大,TNF-α含量越高。結(jié)果表明BAE具有促進(jìn)S180荷瘤小鼠產(chǎn)生TNF-α,從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

    3 結(jié) 論

    本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),利用遺傳算法優(yōu)化得出超聲-閃式聯(lián)合提取藍(lán)莓花色苷的工藝參數(shù)組合:提取時(shí)間10 min、料液比1∶30(g/mL)、 超聲功率450 W、閃提轉(zhuǎn)速8 400 r/min和乙醇體積分?jǐn)?shù)6 8%,在此條件下花色苷含量和純度分別為(2.71±0.08)mg/g和(31.79±0.53)%。通過(guò)方差分析可知,該數(shù)學(xué)模型極顯著,所得的方程擬合度較高,對(duì)花色苷含量的影響主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲 功率>閃提轉(zhuǎn)速。通過(guò)體外S180細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的S180荷瘤小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)BAE具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,其作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)機(jī)體免疫抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果為藍(lán)莓花色苷提取和抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。

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