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    乳酸菌復(fù)配對(duì)紅腸發(fā)酵中N-亞硝胺 生成的抑制作用

    2020-04-02 03:32:24李秀明仇泓博吳晨燕熊鳳嬌劉靜靜馬儷珍
    食品科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:亞硝酸鈉亞硝胺發(fā)酵劑

    李秀明,楊 華,王 洋,仇泓博,吳晨燕,熊鳳嬌,劉靜靜,馬儷珍,

    (1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384;2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384;3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津 300384)

    紅腸是我國(guó)的傳統(tǒng)肉制品,味道鮮嫩脆彈,色澤紅艷,受人喜愛,在東北地區(qū)具有廣闊的消費(fèi)市場(chǎng)。在紅腸加工過程中常添加亞硝酸鹽,可起到發(fā)色、抑菌、抗氧化、提高風(fēng)味的作用,但成品中殘留的亞硝酸鹽有時(shí)會(huì)超標(biāo)(30 mg/kg),對(duì)人體造成危害[1]。亞硝酸根在酸性條件(如呈微酸性的食品或人體胃酸環(huán)境)會(huì)生成一些不穩(wěn)定的氮氧化物[2],和二級(jí)胺類物質(zhì)結(jié)合生成具有致癌、致畸和致突變性的N-亞硝胺[3]。此外,制作紅腸的原料肉中富含蛋白質(zhì)、各種氨基酸,經(jīng)蛋白酶和氨基酸脫羧酶作用會(huì)生成某些胺類物質(zhì)[4],亦為N-亞硝胺的形成提供了充足的前體物。因此在紅腸制作過程中如何控制產(chǎn)品中N-亞硝胺生成量,對(duì)于食品安全和品質(zhì)控制具有十分重要的意義。

    目前對(duì)于如何阻斷腌肉制品中N-亞硝胺的形成,主要從原料選擇[5]、加工方式[6]、外源添加物(抗壞血酸鈉、VE、茶多酚等)等方面進(jìn)行控制[7-8]。近年來,對(duì)益生菌的研究相繼成為關(guān)注焦點(diǎn)。有研究表明,微生物發(fā)酵如植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖片球菌等[9-10]具有降低N-亞硝胺前體物亞硝酸鹽的能力,部分乳酸菌如彎曲乳桿菌、戊糖乳桿菌等[11-13]可直接降解N-亞硝胺。因此利用微生物發(fā)酵技術(shù)(特別是益生菌發(fā)酵)降低肉制品中N-亞硝胺的形成是值得深入探究的課題。然而,目前發(fā)酵劑種類和不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)肉制品中N-亞硝胺的抑制效果方面的研究報(bào)道還較少。

    本實(shí)驗(yàn)將發(fā)酵技術(shù)引入傳統(tǒng)紅腸的加工工藝中,在肉餡中分別接種4 種常應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的商業(yè)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑和經(jīng)篩選得到的3 株可降低發(fā)酵風(fēng)干腸中N-亞硝胺的乳酸菌單菌,發(fā)酵不同的時(shí)間,經(jīng)過熟制得到發(fā)酵紅腸新產(chǎn)品。通過對(duì)產(chǎn)品的感官評(píng)定、pH值、乳酸菌數(shù)、亞硝酸鹽、生物胺和N-亞硝胺等相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定,同時(shí)與空白對(duì)照組對(duì)比,分析乳酸菌發(fā)酵劑及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵紅腸安全品質(zhì)的影響,也為乳酸菌發(fā)酵劑在食品中的應(yīng)用提供了理論參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    新鮮豬后腿肉、豬肥膘 天津市康寧肉制品有限公司; 淀粉、大蒜、雞蛋 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);SHI-59(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌)、WBX-43(肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌)、PRO-MIX5(木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌)、VBM-60(木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌) 意大利薩科公司;彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus,Lc)、戊糖乳桿菌(L. pentosus,Lp)和清酒乳桿菌 (L. sake,Ls)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

    MRS固體培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;乙腈、二氯甲烷(色譜純)、氯化鈉、無水硫酸鈉、硼酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;高氯酸、丙酮、丹磺酰氯、硝酸鈉和亞硝酸鈉標(biāo)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;8 種生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺)標(biāo)品、9 種N-亞硝胺標(biāo)品: N-二甲基亞硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)、N-二乙基亞硝胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA)、N-甲基乙基亞硝胺(N-nitrosomethylethylamine,NMEA)、N-二丁基亞硝胺(N-nitrosodibutylamide,NDBA)、N-二丙基亞硝胺(N-nitrosodipropylamine,NDPA)、N-亞硝基哌啶(N-nitrosopiperidine,NPIP)、N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)、N-亞硝基嗎啉(N-nitrosomorpholine,NMOR)、N-亞硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine,NDPheA) 美國(guó)Sigma公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    7890A氣相色譜儀(配備氮磷檢測(cè)器)、1200高效液相色譜儀(配備紫外吸收檢測(cè)器) 美國(guó)安捷倫公司;P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(配備紫外檢測(cè)器) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾勒公司;PB-10酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;BPX-82恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博訊儀器設(shè)備有限公司;BJRJ-82絞肉機(jī)、BVBJ-30F真空攪拌機(jī)、BYXX-50煙熏爐 浙江嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 發(fā)酵紅腸的加工方法

    各實(shí)驗(yàn)組紅腸的工藝流程:原料選擇→腌制→拌餡(接種)→灌腸→發(fā)酵→干燥→煙熏→蒸煮→烘烤→冷卻→成品。

    腌制:稱取用絞肉機(jī)絞碎的豬后腿肉1 600 g,添加料酒40 g、食鹽56 g、葡萄糖8 g、白糖8 g、復(fù)合磷酸鹽8 g、抗壞血酸鈉1.1 g、亞硝酸鈉0.3 g、水80 mL,于4 ℃冰箱中腌制20 h。

    拌餡灌腸:向腌好的肉中加入肥膘丁400 g、淀粉160 g、蒜泥40 g、白胡椒粉4.8 g、雞蛋160 g、冰水320 g,在此步驟接種不同種類的乳酸菌發(fā)酵劑,再用真空攪拌機(jī)充分拌勻后灌腸。

    發(fā)酵:于35 ℃,80%相對(duì)濕度條件下發(fā)酵。

    熟制:將灌好的腸經(jīng)溫水漂洗、排氣后于煙熏爐中熟制,熟制參數(shù)為:干燥70 ℃ 60 min、煙熏85 ℃ 60 min、蒸煮85 ℃ 60 min、烘烤75 ℃ 60 min。

    1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

    本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共分為8 組:空白對(duì)照(control check,CK)組,不接種發(fā)酵劑。其余7 組分別接種4 種商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑(SHI-59組、WBX-43組、PRO-MIX5組和VBM-60組)和3 株單菌(Lc組、Lp組和Ls組)。

    將以上不同菌株在拌餡時(shí)以107CFU/g添加量加入,分別發(fā)酵12、16、20、24 h,在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定樣品的乳酸菌數(shù)變化,并將發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行熟制,冷卻后得到成品,取樣進(jìn)行感官評(píng)定、pH值、亞硝酸鹽、硝酸鹽、生物胺、N-亞硝胺的測(cè)定。CK組不接菌不發(fā)酵,僅測(cè)定熟制后成品的各項(xiàng)指標(biāo)。

    1.3.3 指標(biāo)測(cè)定方法

    1.3.3.1 感官評(píng)定方法

    表 1 發(fā)酵紅腸成品的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented sausage products

    選擇10 位經(jīng)培訓(xùn)合格的感官評(píng)定人員先對(duì)4 個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的各組紅腸進(jìn)行初步篩選,排除口感上無法接受的組別,再對(duì)剩余各組發(fā)酵紅腸成品按照表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)定。

    1.3.3.2 乳酸菌數(shù)的測(cè)定

    參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》方法。

    1.3.3.3 pH值的測(cè)定

    參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》方法。

    1.3.3.4 亞硝酸鈉和硝酸鈉的測(cè)定

    使用毛細(xì)管電泳法[14]同時(shí)測(cè)定樣品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量。

    1.3.3.5 生物胺的測(cè)定

    參照杜智慧[15]的方法測(cè)定樣品中的8 種生物胺:色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺。

    1.3.3.6 N-亞硝胺的測(cè)定

    參照GB 5009.26—2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》測(cè)定樣品中的9 種N-亞硝胺(NDMA、NDEA、NMEA、NDBA、NDPA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPheA),同時(shí)用外標(biāo)法分析定量。

    1.3.4 數(shù)據(jù)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵12 h的7 組紅腸成品與CK組感官評(píng)價(jià)結(jié)果

    表 2 7 組發(fā)酵紅腸和CK組的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of control and experimental fermented sausages

    發(fā)酵紅腸加工中,經(jīng)接種7 種發(fā)酵劑,并發(fā)酵不同時(shí)間,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)(12 h→24 h),發(fā)酵紅腸的氣味及滋味明顯變差,發(fā)酵16 h及以上產(chǎn)生明顯的酸味且不被感官評(píng)價(jià)者所接受,因此本研究?jī)H對(duì)發(fā)酵至第12小時(shí)的不同發(fā)酵紅腸產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定。如表2所示, 8 組紅腸產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)由好到差依次為:SHI-59>CK> Lc>Ls>Lp>W(wǎng)BX-43>PRO-MIX5>VBM-60。其中SHI-59組發(fā)酵紅腸感官更容易被人接受,該組發(fā)酵紅腸口感微酸、有發(fā)酵香味、無異味、切片性良好、發(fā)色正常、滋味較好,接受度較高。VBM-60組則口感偏酸,發(fā)酵異味感較重,接受度較低。造成不同組口感區(qū)別的原因可能是由于不同乳酸菌發(fā)酵劑活力存在差異,雖在同一發(fā)酵時(shí)間,但不同組發(fā)酵程度不同;且發(fā)酵劑菌種組成不同,可能是由于發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如香味、滋味等成分[16]存在較大差異。

    2.2 不同乳酸菌復(fù)配組在發(fā)酵的不同時(shí)間點(diǎn)乳酸菌數(shù)動(dòng)態(tài)變化

    表 3 各組樣品在不同發(fā)酵時(shí)間的乳酸菌數(shù)變化Table 3 Changes in lactic acid bacterial number with fermentation time

    如表3所示,在發(fā)酵至第12小時(shí),PRO-MIX5和VBM-60兩組的乳酸菌總數(shù)分別達(dá)到8.64(lg(CFU/g)) 和8.40(lg(CFU/g)),菌活性較強(qiáng),而其他各組乳酸菌數(shù)均在5.16~6.79(lg(CFU/g))范圍。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),各組乳酸菌數(shù)整體呈上升趨勢(shì),但SHI-59組、VBM-60組、Ls組在發(fā)酵20 h后乳酸菌數(shù)有所下降,可能是由于在發(fā)酵后期,乳酸菌進(jìn)入衰亡期。Lc和Lp組在發(fā)酵12~24 h期間乳酸菌數(shù)呈緩慢上升趨勢(shì),且均顯著低于其他組(P<0.05),說明這兩組發(fā)酵劑活力低或不適宜在這一體系中生長(zhǎng)。不同乳酸菌發(fā)酵劑活力不同,進(jìn)入衰亡期的時(shí)間以及最大菌活力也有所差異[17],如WBX-43組在發(fā)酵至第20小時(shí)乳酸菌數(shù)已達(dá)到9.04(lg(CFU/g)), 顯著高于其他各組(P<0.05)。由此可見,不同的乳酸菌發(fā)酵劑具有不同的活力,其在不同發(fā)酵時(shí)間菌數(shù)的增長(zhǎng)速度以及生長(zhǎng)特性亦有較大差異,因此篩選在紅腸肉餡體系中適宜生長(zhǎng)的發(fā)酵劑顯得尤為重要。

    2.3 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的pH值隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

    如圖1所示,各組pH值均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì),其中PRO-MIX5和VBM-60組的pH值顯著低于其他5 組(P<0.05),在發(fā)酵至第12小時(shí),pH值分別為5.24和5.34,與表3中乳酸菌數(shù)變化趨勢(shì)一致,這是由于這兩組乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)較快,生成的乳酸量大。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得CK組pH值為6.4,WBX-43、SHI-59、Lc、Lp、Ls在發(fā)酵至第12小時(shí)pH值差異不顯著,且均略低于CK組,當(dāng)發(fā)酵至第16小時(shí),5 組之間的pH值顯示出顯著差異 (P<0.05),這種趨勢(shì)一直保持到發(fā)酵24 h,此時(shí)5 組pH值下降程度由大到小順序依次為:WBX-43>Ls>SHI-59>Lc>Lp,這與乳酸菌發(fā)酵劑的產(chǎn)酸能力和活力有關(guān)[18]。

    圖 1 7 組發(fā)酵紅腸的pH值隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化Fig. 1 Changes in pH during sausage fermentation

    2.4 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的硝酸鈉和亞硝酸鈉隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

    7 組發(fā)酵紅腸的硝酸鈉和亞硝酸鈉隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化見圖2。CK組亞硝酸鈉含量為41.63 mg/kg, 從圖2A可以看出,PRO-MIX5和VBM-60組在第12小時(shí)亞硝酸鈉含量明顯低于其他5 組,其含量分別為 7.58 mg/kg和11.01 mg/kg,且隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),亞硝酸鈉殘留量變化不顯著(P>0.05),這是由于這兩組發(fā)酵劑在發(fā)酵初期菌活力已呈較高狀態(tài),產(chǎn)生了大量乳酸和亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鈉[19-20],而在發(fā)酵后期作用不顯著;其他5 組亞硝酸鈉殘留量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)整體呈不同程度的下降趨勢(shì)。張慶芳等[21]研究報(bào)道,當(dāng)pH>4.5時(shí),亞硝酸鹽主要以酶降解為主,在整個(gè)發(fā)酵過程中,各組pH值均在4.5以上,說明各組在發(fā)酵過程中對(duì)亞硝酸鹽的降解主要是亞硝酸鹽還原酶的作用[22],且偏酸性的環(huán)境也為降解率做出了一定的貢獻(xiàn)。

    硝酸鹽對(duì)人體無直接毒性,國(guó)標(biāo)中規(guī)定西式火腿中硝酸鹽和亞硝酸鹽的最大使用量分別為0.5 g/kg和 0.15 g/kg,限定亞硝酸鹽殘留量分別為30 mg/kg和70 mg/kg, 但對(duì)硝酸鹽殘留量并未限定[23]。但其會(huì)在口腔或胃液中硝酸鹽還原菌作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽,表現(xiàn)為亞硝酸鹽的作用毒性[24]。若產(chǎn)品中硝酸鹽含量較多,在貯存期間一些腐敗菌對(duì)硝酸鹽還原,將會(huì)使肉制品存在潛在的安全隱患。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得CK組中硝酸鈉含量為161.00 mg/kg, 由圖2B可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),各組發(fā)酵紅腸中硝酸鹽含量呈降低趨勢(shì),說明接菌發(fā)酵后可降低發(fā)酵紅腸中硝酸鹽含量,但整體測(cè)得的含量相對(duì)較高,均在90 mg/kg以上。其中VBM-60組在發(fā)酵12 h即能夠較好地降低硝酸鹽含量,這可能是由于該組發(fā)酵菌活力相對(duì)較強(qiáng),產(chǎn)生了一些可降解硝酸鹽的還原酶,被菌體本身生長(zhǎng)所利用,亦有可能被轉(zhuǎn)化為含氮物質(zhì)與胺類結(jié)合形成N-亞硝胺。

    圖 2 7 組發(fā)酵紅腸發(fā)酵不同時(shí)間亞硝酸鈉和硝酸鈉含量的變化Fig. 2 Changes in sodium nitrite and sodium nitrate contents during sausage fermentation

    2.5 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的生物胺含量隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

    生物胺是一類脂肪族、芳香族或雜環(huán)類低分子含氮化合物,在發(fā)酵香腸中生物胺的含量與原料肉的品質(zhì)、發(fā)酵劑種類、發(fā)酵溫度、pH值、含鹽量、生物胺氧化酶、添加劑等因素有關(guān)[25],它主要是由于微生物作用蛋白質(zhì)使其降解為氨基酸,再由氨基酸脫羧反應(yīng)生成,在調(diào)節(jié)核酸和蛋白質(zhì)的合成、生物膜穩(wěn)定性以及生長(zhǎng)發(fā)育方面均有著重要作用[26],但過量攝入生物胺則對(duì)身體有極大危害。目前僅有部分國(guó)家對(duì)食品中生物胺制定了限量標(biāo)準(zhǔn),如歐盟規(guī)定食品中組胺和酪胺含量分別不得超過100 mg/kg和100~800 mg/kg,國(guó)內(nèi)僅在上海地方標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)酵肉制品組胺不得超過100 mg/kg[27]。

    由表4可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),各組發(fā)酵紅腸中8 種生物胺含量在逐漸增多,這是由于隨著乳酸菌數(shù)增加,脫羧酶活性增強(qiáng),使得蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生了生物胺;且生物胺作為細(xì)胞生長(zhǎng)過程中重要的物質(zhì),總生物胺也會(huì)隨乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)而增多。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),各組發(fā)酵紅腸在不同發(fā)酵時(shí)間均檢測(cè)出腐胺和精胺,發(fā)酵12~20 h,各組紅腸中所產(chǎn)生的腐胺和精胺含量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì),而在20~24 h之間變化不顯著(P>0.05)。在發(fā)酵至第12小時(shí),Lc和Ls組兩組除腐胺和精胺外,還檢測(cè)出尸胺和酪胺,腐胺和尸胺作為一種二胺,能夠和亞硝酸鹽反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺,常見的生物胺中以組胺毒性最大,其次是酪胺[28],因此相比之下用Lc和Ls發(fā)酵的紅腸產(chǎn)品安全品質(zhì)相對(duì)較低。

    表 4 7 組發(fā)酵紅腸的生物胺含量隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化Table 4 Changes in biogenic amines contents during sausage fermentation

    隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),脫羧酶活性不斷增強(qiáng),發(fā)酵紅腸中生物胺種類逐漸增多,且含量明顯增加,如苯乙胺、尸胺、酪胺。Lc組尸胺含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì),且由于各組乳酸菌發(fā)酵劑的特性不同,其他各組也在不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)生了一定量的酪胺。值得注意的是在發(fā)酵至第24小時(shí),VBM-60、Lc和Lp組中產(chǎn)生了組胺。雖然其含量并未超過一些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,但是此時(shí)各組發(fā)酵紅腸生物胺含量均較高。因此相比之下發(fā)酵時(shí)間以12 h為好,此時(shí)Lp組腐胺(144.50 mg/kg)和精胺含量(57.32 mg/kg)、Ls組精胺含量(59.14 mg/kg)顯著低于CK組(腐胺:181.25 mg/kg;精胺:129.09 mg/kg) (P<0.05),其中Lp組總生物胺含量(201.81 mg/kg)顯著低于其他各組(P<0.05),結(jié)合乳酸菌數(shù)變化,這可能是由于Lp和Ls菌活力弱,所產(chǎn)生的蛋白酶以及氨基酸脫羧酶活力低的緣故。相較于CK組,SHI-59、 PRO-MIX5、VBM-60、Ls組與CK組8 種生物胺的總含量之間差異不顯著(P>0.05)。

    2.6 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的N-亞硝胺含量隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

    表 5 CK組紅腸9 種N-亞硝胺含量Table 5 Contents of 9 N-nitrosamines in control group μg/kg

    對(duì)照CK組紅腸中9 種N-亞硝胺含量如表5所示,7 組發(fā)酵紅腸中9 種N-亞硝胺總量隨發(fā)酵時(shí)間的變化如表6所示。

    表 6 7 組發(fā)酵紅腸發(fā)酵不同時(shí)間9 種N-亞硝胺總量的變化Table 6 Changes in total amount of N-nitrosamines during sausage fermentation μg/kg

    由表6可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),除PRO-MIX5和Lc組外,各組紅腸所含N-亞硝胺總量呈逐漸降低趨勢(shì),這可能是由于在發(fā)酵過程中乳酸菌大量增長(zhǎng),產(chǎn)生一些可降解N-亞硝胺的酶系[29],或菌體本身對(duì)一些 N-亞硝胺具有吸附作用[30],降解或吸附了發(fā)酵前期產(chǎn)生的部分N-亞硝胺。發(fā)酵至第12小時(shí),PRO-MIX5和Lc組中 N-亞硝胺總量顯著低于CK組(表5),經(jīng)短時(shí)間發(fā)酵即可起到降低產(chǎn)品中N-亞硝胺的作用。在隨后發(fā)酵16~24 h范圍時(shí),除發(fā)酵至第16小時(shí)的SHI-59、PRO-MIX5、Lp組和發(fā)酵至第20小時(shí)的PRO-MIX5組外,其余各時(shí)間點(diǎn)的各組發(fā)酵紅腸所含N-亞硝胺總量均顯著低于CK組 (P<0.05);特別是當(dāng)發(fā)酵至第24小時(shí),各組N-亞硝胺總量均顯著下降,抑制效果十分顯著。

    目前國(guó)標(biāo)僅限量肉制品中NDMA含量為3 μg/kg[31],本實(shí)驗(yàn)中CK組中NDMA含量為5.15 μg/kg(表5),超過了國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)接菌發(fā)酵后,部分乳酸菌發(fā)酵劑可抑制NDMA的形成,且發(fā)酵劑的組成不同,活性也有差異,因此在不同發(fā)酵時(shí)間NDMA含量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)區(qū)別較大。由圖3可以看出,WBX-43、Lp組中NDMA含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著降低趨勢(shì),Ls組在發(fā)酵12~20 h,NDMA含量呈顯著降低趨勢(shì),但在發(fā)酵后期至第24小時(shí),NDMA含量有所升高,可能是由于在發(fā)酵后期NDMA蓄積;VBM-60組在發(fā)酵過程中NDMA含量相較于其他發(fā)酵組整體較低;Lc組則除發(fā)酵至第20小時(shí)有所升高,其他發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)均較低,說明在應(yīng)用該種發(fā)酵劑降解NDMA時(shí),需控制一定的發(fā)酵時(shí)間才可達(dá)到較好的效果;SHI-59、PRO-MIX5兩組中的NDMA則呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。因此對(duì)于抑制NDMA效果來看,PROMIX5、VBM-60和Lc組相對(duì)于其他各組可在較短發(fā)酵時(shí)間內(nèi)降低NDMA形成,分別使NDMA含量降低至2.91、0.77 、1.08 μg/kg。

    對(duì)于除NDMA以外的其他8 種N-亞硝胺,目前無國(guó)標(biāo)規(guī)定限量。相比CK組,如圖3B、C所示,除發(fā)酵至第12、16小時(shí)的VBM-60組和發(fā)酵至第16小時(shí)的SHI-59組外,各發(fā)酵組在各個(gè)發(fā)酵時(shí)間對(duì)NMEA均有抑制效果;對(duì)于NDEA,除發(fā)酵至第12小時(shí)的SHI-59和Ls組,其余各發(fā)酵時(shí)間的各組均能顯著降低NDEA含量。如圖3E所示,在發(fā)酵至第24小時(shí),7 種乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的紅腸中NDBA均顯著低于CK組,這說明長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵可降低NDBA的含量;如圖3F所示,對(duì)于NPIP,SHI-59組對(duì)其抑制呈現(xiàn)較強(qiáng)規(guī)律性,隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),在16~24 h,逐漸降低了該組發(fā)酵紅腸中的NPIP含量;而對(duì)于NPYR(圖3G)和NDPheA(圖3I),各個(gè)發(fā)酵組在不同發(fā)酵時(shí)間的含量并未呈現(xiàn)較強(qiáng)規(guī)律性。相反,如圖3D、H所示,接種乳酸菌發(fā)酵后對(duì)NDPA、NMOR的生成并未起到抑制效果,反而具有一定的促進(jìn)作用。

    結(jié)合以上分析結(jié)果,雖然整體呈現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng),N-亞硝胺含量越低的趨勢(shì),其中PRO-MIX5和Lc兩種發(fā)酵劑在短時(shí)間內(nèi)即可起到顯著降低9 種N-亞硝胺總量的效果;對(duì)于國(guó)標(biāo)中有限定標(biāo)準(zhǔn)的NDMA,PRO-MIX5、Lc和Lp三種發(fā)酵劑在發(fā)酵至第12小時(shí)已達(dá)到較好的抑制效果,應(yīng)用效果好。

    圖 3 7 組發(fā)酵紅腸發(fā)酵不同時(shí)間9 種N-亞硝胺含量的變化Fig. 3 Changes in contents of nine N-nitrosamines during sausage fermentation

    3 討 論

    根據(jù)以上各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行綜合分析,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),各組乳酸菌數(shù)以不同速度增長(zhǎng),8 種生物胺含量逐漸升高,pH值、亞硝酸鹽和硝酸鹽殘留量則呈降低趨勢(shì),其中硝酸鹽殘留量整體在90~169 mg/kg之間,硝酸鹽主要表現(xiàn)為亞硝酸鹽毒性,但會(huì)受到口腔中的硝酸鹽還原酶和病理狀態(tài)下胃液中的硝酸鹽還原菌作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[32],本研究經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,硝酸鹽殘留量適度下降,一定程度地提高了產(chǎn)品安全性。但有所不同的是,有研究表明,亞硝酸根離子在酸性環(huán)境中更容易產(chǎn)生一些N2O3等氮氧化物和胺類物質(zhì)結(jié)合生成N-亞 硝胺[33-34],而本研究發(fā)現(xiàn)各發(fā)酵組紅腸中9 種N-亞硝胺含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈降低趨勢(shì),這可能是由于乳酸菌能夠產(chǎn)生一些抑制N-亞硝胺形成的物質(zhì),如 肖亞慶等[35]發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌中位于細(xì)胞壁最外層的表層蛋白具有降解NDMA和NDEA的效果,隨著乳酸菌數(shù)增長(zhǎng),這些可抑制N-亞硝胺的物質(zhì)不斷蓄積,從而使得所得發(fā)酵紅腸產(chǎn)品中N-亞硝胺含量降低。但發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng),會(huì)使得一些生物胺含量增加,過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致嘔吐、呼吸困難等癥狀[36];且對(duì)于本無發(fā)酵工藝的紅腸來說,長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵對(duì)風(fēng)味破壞嚴(yán)重,口感偏酸,不能夠被品評(píng)者接受,因此選擇適度發(fā)酵12 h為佳。

    本研究所篩選的7 種乳酸菌發(fā)酵劑中,其中 PRO-MIX5和VBM-60兩種乳酸菌活力最強(qiáng),產(chǎn)酸能力、亞硝酸鹽的降解速度均顯著優(yōu)于其他各組,兩種發(fā)酵劑在適度發(fā)酵至第12小時(shí)即可顯著降低9 種N-亞硝胺含量,且PRO-MIX5組中8 種生物胺總量與CK組差異不顯著。綜合來看,PRO-MIX5提高紅腸產(chǎn)品安全品質(zhì)應(yīng)用效果較好。對(duì)于增加發(fā)酵技術(shù)的紅腸的口感,還需進(jìn)行一定的消費(fèi)引導(dǎo),或在后期進(jìn)一步深入研究,提取乳酸菌增長(zhǎng)所產(chǎn)生的能夠抑制N-亞硝胺的物質(zhì),直接添加至肉餡中,以達(dá)到既提高產(chǎn)品品質(zhì)又不影響產(chǎn)品風(fēng)味的效果,甚至可應(yīng)用于其他肉制品中,將會(huì)有更實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

    4 結(jié) 論

    本研究結(jié)果表明,使用PRO-MIX5乳酸菌發(fā)酵劑接種至紅腸肉餡中,經(jīng)發(fā)酵12 h,乳酸菌數(shù)達(dá)到 8.64(lg(CFU/g)),可顯著降低9 種N-亞硝胺總量至8.68 μg/kg,降低NDMA至3.07 μg/kg;紅腸pH值為5.24;顯著降低亞硝酸鹽殘留量至7.58 mg/kg,硝酸鹽含量為141.84 mg/kg;8 種生物胺總量為320.15 mg/kg,且與CK組差異不顯著。該種發(fā)酵劑相比其他6 種能夠顯著提高發(fā)酵紅腸的安全品質(zhì),也為制作新型發(fā)酵紅腸提供了理論指導(dǎo)。

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