嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的C末端 結(jié)構(gòu)域功能及生淀粉結(jié)合位點(diǎn)分析

曾 靜，郭建軍，涂熠坤，袁 林,

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

生淀粉α-淀粉酶是指能對(duì)不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒表現(xiàn)出強(qiáng)水解活性的α-淀粉酶[1-4]。生淀粉α-淀粉酶可以在低于糊化溫度條件下直接作用于未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉顆粒，在淀粉液化過程中能夠省去生淀粉糊化步驟，有利于節(jié)約能源和簡化工藝，因此生淀粉α-淀粉酶在釀造、食品、造紙、紡織等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

生淀粉α-淀粉酶往往是多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，除催化結(jié)構(gòu)域，還包含一個(gè)不具有催化功能的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域（starch binding domain，SBD），這是它能夠直接水解未經(jīng)糊化處理的生淀粉顆粒的關(guān)鍵[5-8]。SBD屬于碳水化合物結(jié)合分子（carbohydrate-binding modules，CBM）[9-12]。 SBD作為生淀粉酶的天然部分主要可使淀粉酶分子可以在溶液中與不溶性底物（淀粉顆粒）結(jié)合，將底物運(yùn)送到催化結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)以及使淀粉顆粒表面破裂。SBD通常位于酶的N-末端或C-末端，微生物來源的生淀粉α-淀粉酶的SBD結(jié)構(gòu)域一般位于其分子結(jié)構(gòu)的C末端。SBD的蛋白質(zhì)序列一般由90～130 個(gè)氨基酸殘基組成，通常在與催化結(jié)構(gòu)域分離的情況下仍能發(fā)揮功能。SBD與生淀粉的結(jié)合主要依靠芳香族氨基酸（特別是Trp）與葡萄糖環(huán)的堆積作用。

來源于嗜熱菌Geobacillus thermoleovorans的嗜熱酸性α-淀粉酶Gt-amy屬于生淀粉α-淀粉酶，具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，并且不依賴于Ca2+，可在淀粉液化工藝條件下有效酶解玉米淀粉[13]。因此Gt-amy在淀粉液化工藝具有巨大的應(yīng)用潛力。Gt-amy的模擬分子結(jié)構(gòu)顯示其由結(jié)構(gòu)域A、B和C三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。利用NCBI網(wǎng)站的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）對(duì)Gt-amy的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)域C中C-末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD，Lys470～Phe549）屬于未知功能結(jié)構(gòu)域[14]。 Gt-amy CTD由β片層結(jié)構(gòu)組成，這符合B型CBM的結(jié)構(gòu) 特征[15]。但是CTD的氨基酸序列與其他已知的CBM無序列相似性，因此無法通過序列分析推斷其功能。本研究通過對(duì)Gt-amy CTD進(jìn)行缺失突變確定其在Gt-amy結(jié)合和降解生淀粉中的作用。在此基礎(chǔ)上，對(duì)CTD中色氨酸殘基Trp進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過比較CTD與突變體的生淀粉結(jié)合能力，確定CTD中參與生淀粉結(jié)合的氨基酸殘基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB600、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pSTOP1622、Gt-amy表達(dá)載體pSTOP1622-gtamyhds均由本實(shí)驗(yàn)室保存；K O D-P l u s-n e o D N A 聚合酶 日本Toyobo公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國Omega BioTek公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 美國Fermentase公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、木糖、咪唑 生工生物工程（上海）股份有限公司；玉米淀粉 美國Sigma公司；試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Eppendorf公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

以來源于Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶BstA（PDB ID：1hvxA）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為模板[16]，采用Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org）模建Gt-amy（Ala35～Phe516）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[17]。采用NCBI的在線軟件BLASTP和CDD對(duì)蛋白序列進(jìn)行相似性分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）。從CAZy（Carbohydrate-Active Enzyme）數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html）中搜索獲得已知生淀粉酶的SBD序列[18]。采用ClustalX 2.0.8軟件對(duì)CTD及SBD序列進(jìn)行序列比對(duì)，并采用MEGA 5.2建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.2 重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-Th和pSTOP1622-ctdh的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，采用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），獲得編碼催化結(jié)構(gòu)域的基因gtamy-Th。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和Sph I雙酶切，連接至經(jīng)相同酶切處理的載體pSTOP1622，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamy-Th。以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，采用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），獲得編碼CTD的基因ctdh。重組質(zhì)粒pSTOP1622-ctdh的構(gòu)建方法同上。采用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Sph I共同處理重組質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

表 1 用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的引物Table 1 Sequences of primers used for the construction of recombinant plasmids

1.3.3 CTD相關(guān)定點(diǎn)突變體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)QuikChange?點(diǎn)突變?cè)噭┖械脑恚Y(jié)合 α-淀粉酶Gt-amy基因gtamy和擬突變的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物W471A-F、W471A-R、W501A-F、W501A-R、W514A-F、W514A-R、W526A-F、W526A-R、W533A-F、W533A-R、W540A-F、W540A-R、W548A-F、W548A-R（表1），構(gòu)建CTD相關(guān)定點(diǎn)突變體W471A、W501A、W514A、W526A、W533A、W540A、W548A、W501A/W514A。以定點(diǎn)突變體W501A/W514A的構(gòu)建為例，以重組質(zhì)粒pSTOP1622-ctdh為模板，采用引物W501A-F和W501A-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴(kuò)增條件與1.3.2節(jié)中PCR擴(kuò)增條件相同。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Dpn I酶處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將轉(zhuǎn)化子涂布于卡那霉素抗性平板，篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測(cè)序鑒定是否為突變基因W501A。在此基礎(chǔ)上，以pSTOP1622-ctdhW501A為模板，采用引物W514A-F和W514A-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，獲得重組質(zhì)粒pSTOP1622-ctdhW501A/W514A。將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

1.3.4 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的Spizizen法[19]進(jìn)行。重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和純化參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。

利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測(cè)重組蛋白質(zhì)，并采用Bradford法測(cè)定重組蛋白質(zhì)含量[21]。

1.3.5 α-淀粉酶活力測(cè)定

將10 μL酶液與490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉的50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）緩沖液（pH 5.0）混合，于80 ℃反應(yīng)30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

用50 mmol/L MES緩沖液（pH 5.0）配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)可溶性淀粉溶液或玉米淀粉溶液（0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%），分別向可溶性淀粉溶液或玉米淀粉溶液中加入等量的酶液，按照1.3.5節(jié)方法測(cè)定酶活力。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶比活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計(jì)算以可溶性淀粉或玉米淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km、反應(yīng)常數(shù)kcat。

1.3.7 重組蛋白質(zhì)對(duì)玉米淀粉結(jié)合率及降解率的測(cè)定

用0.5 mL 50 mmol/L MES緩沖液（pH 5.0）配制玉米淀粉溶液（其中玉米淀粉質(zhì)量分別為0、25、50、75、100、125、150 mg），分別向玉米淀粉溶液中加入50 μL 60 μmol/L的重組蛋白質(zhì)，混合體系在20 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。待孵育結(jié)束后，將反應(yīng)液于12 000×g離心10 min，分別收獲沉淀和上清液，然后采用Bradford法測(cè)定上清液中重組蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。結(jié)合率計(jì)算如式（1）所示：

式中：R為上清液中重組蛋白質(zhì)質(zhì)量；O為初始重組蛋白質(zhì)質(zhì)量。

取30 g/100 mL玉米淀粉的50 mmol/L MES緩沖液（pH 5.0）與0.1 U/mg（以淀粉質(zhì)量計(jì)）的酶液混合，于60 ℃反應(yīng)3 h后，用DNS法測(cè)定上清液中還原糖量。玉米淀粉降解率如式（2）所示：

1.3.8 CTD對(duì)玉米淀粉結(jié)合能力的測(cè)定

取30 g/100 mL生玉米淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液與30 μg的CTD混合，混合體系在20 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。孵育結(jié)束后，12 000×g離心10 min，獲得沉淀和上清液，用于SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.9 玉米淀粉的掃描電鏡觀察

取5 g/100 mL玉米淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液與0.1 U/mg（以淀粉質(zhì)量計(jì)）的酶液混合，于60 ℃反應(yīng)3 h后，12 000×g離心10 min，獲得沉淀。用無水乙醇洗滌沉淀3 次后，將沉淀置于玻璃器皿中自然風(fēng)干。使用離子濺射儀Ion Sputter E-1010于5.0 kV和20 mA的條件下處理淀粉顆粒噴40 s，使淀粉顆粒表面鍍Pt，然后采用VEGA3-TESCAN掃描電鏡觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生淀粉α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。運(yùn)用軟件SigmaPlot 12.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gt-amy的結(jié)構(gòu)域和序列分析

圖 1 Gt-amy的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示圖Fig. 1 Tertiary structure of Gt-amy

如圖1所示，Gt-amy的三級(jí)結(jié)構(gòu)由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即結(jié)構(gòu)域A（Ala35～Asp139和Asp241～Tyr430）、結(jié) 構(gòu) 域B （ H i s 1 4 0 ～A s n 2 4 0 ） 和 結(jié) 構(gòu) 域C（Gly431～Phe549）。采用NCBI的在線軟件CDD對(duì) Gt-amy的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示Gt-amy中不存在可能的SBD。同時(shí)保守結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果顯示Gt-amy的CTD（Lys470～Phe549）為未知功能結(jié)構(gòu)域（domain of unknown function，DUF1939，CDD286264）。由圖1可以看出，CTD由β片層結(jié)構(gòu)組成，CTD的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與B型CBM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相符。但是CTD與來源于不同CBM家族（CBM20、CBM25、CBM26、CBM41、CBM48、CBM69）的SBD序列以及一些α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域C的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖2）顯示，CTD與來源于Bacillus licheniformis的α-淀粉酶BLA結(jié)構(gòu)域C的進(jìn)化關(guān)系最近，CTD與其他SBD序列的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。并且CTD與SBD的序列比對(duì)結(jié)果顯示CTD與已知的SBD無明顯序列相似性（結(jié)果未顯示）。以上結(jié)果表明，CTD不屬于典型的SBD，由結(jié)構(gòu)域和序列分析無法預(yù)測(cè)CTD的功能。因此，本研究通過對(duì)Gt-amy CTD進(jìn)行缺失突變，并比較Gt-amy與CTD缺失突變體Gt-amy-T對(duì)生淀粉的結(jié)合能力和降解能力確定CTD的功能。

圖 2 CTD的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of the CTD of Gt-amy

2.2 重組蛋白質(zhì)Gt-amy、Gt-amy-T及CTD的表達(dá)與純化

圖 3 重組蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模式圖及SDS-PAGE圖Fig. 3 Schematic representation and SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins

重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化結(jié)果如圖3所示。目的蛋白質(zhì)Gt-amy、Gt-amy-T以及CTD均得到成功表達(dá)，且主要位于細(xì)胞可溶成分中。采用Ni2+親和層析柱對(duì)重組細(xì)胞可溶成分中的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，得到純化后的重組蛋白質(zhì)Gt-amy、Gt-amy-T以及CTD。Gt-amy、Gt-amy-T和CTD的表觀分子質(zhì)量分別約為56、47、9 kDa，三者的大小均與理論值相符。

2.3 重組蛋白質(zhì)Gt-amy、Gt-amy-T及CTD對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率和降解率

圖 4 CTD對(duì)玉米淀粉結(jié)合率（A）及降解率（B）的影響Fig. 4 Effect of the CTD on raw corn starch adsorption (A) and hydrolysis (B)

為研究CTD對(duì)Gt-amy結(jié)合玉米淀粉的影響，本研究比較了重組蛋白質(zhì)Gt-amy、Gt-amy-T及CTD對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率，結(jié)果如圖4A所示。隨著反應(yīng)體系中玉米淀粉質(zhì)量濃度的提高，Gt-amy及CTD對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率也逐漸提高，而Gt-amy-T不能結(jié)合玉米淀粉。當(dāng)反應(yīng)體系中玉米淀粉質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/100 mL時(shí)，Gt-amy及CTD對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率達(dá)到最高，其中Gt-amy對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率為78.8%，CTD對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率為84.5%。在玉米淀粉質(zhì)量濃度為0～30 g/100 mL范圍內(nèi)，CTD對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率均高于Gt-amy，這可能是由于CTD是小分子蛋白質(zhì)，與Gt-amy相比，CTD更易與玉米淀粉顆粒結(jié)合。

以上研究結(jié)果表明，CTD具有結(jié)合玉米淀粉的能力，并且CTD介導(dǎo)Gt-amy結(jié)合玉米淀粉。對(duì)于含有SBD或生淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域的生淀粉酶，缺失該結(jié)構(gòu)會(huì)影響生淀粉酶的生淀粉結(jié)合率。但該區(qū)域的缺失對(duì)不同淀粉酶的生淀粉降解率的影響不同。例如，對(duì)于來源于L. amylovorus的α-淀粉酶[23]以及來源于G.thermolovorans的α-淀粉酶Gt-amyII[24]，SBD缺失突變體或CTD缺失突變體完全喪失了降解生淀粉的能力。對(duì)于來源于Bacteroides thetaiotaomicron的α-淀粉酶SusG，其SBD缺失突變體對(duì)生淀粉的比酶活力約為SusG的30%[25]。而對(duì)于來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶[26]和來源于Thermoanaerobacter ethanolicus39E的淀粉普魯蘭酶[27]，SBD的缺失不影響其生淀粉降解能力。這說明對(duì)于一些淀粉酶，其生淀粉結(jié)合域并不是降解生淀粉所必需的。已有研究表明，生淀粉α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)域C參與生淀粉的結(jié)合，例如結(jié)構(gòu)域C of barely α-amylase[28]，結(jié)構(gòu)域C of Gt-amyII[24]。此外，來源于B. licheniformis的 α-淀粉酶BLA已被證實(shí)可有效降解玉米淀粉[29-30]，其結(jié)構(gòu)域C與Gt-amy CTD進(jìn)化關(guān)系較近（圖2），BLA的結(jié)構(gòu)域C中是否也結(jié)合生淀粉則有待證實(shí)。另外，一些特殊的生淀粉酶不含有生淀粉結(jié)合域，卻可以降解生淀粉，可能原因是其分子結(jié)構(gòu)中存在生淀粉結(jié)合位點(diǎn)[31]。

為研究CTD對(duì)Gt-amy降解玉米淀粉的影響，比較 Gt-amy及Gt-amy-T對(duì)30 g/100 mL玉米淀粉的降解率?？紤]到玉米淀粉的糊化開始溫度為64 ℃，將反應(yīng)體系置于60 ℃進(jìn)行反應(yīng)。由圖4B可以看出，Gt-amy和Gt-amy-T對(duì)玉米淀粉的降解率隨時(shí)間的延長而提高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3 h，Gt-amy對(duì)玉米淀粉的降解率為65.8%；而 Gt-amy-T對(duì)玉米淀粉的降解率僅為2.8%。此外，掃描電鏡觀察結(jié)果（圖5）顯示，經(jīng)Gt-amy處理后的玉米淀粉可觀察到明顯的被降解現(xiàn)象；而經(jīng)Gt-amy-T處理后的玉米淀粉則無明顯變化。以上研究結(jié)果均表明，Gt-amy可有效酶解玉米淀粉，Gt-amy-T不能酶解玉米淀粉。這說明CTD在Gt-amy酶解玉米淀粉過程中發(fā)揮重要作用。

圖 5 玉米淀粉的掃描電鏡圖Fig. 5 SEM images of raw corn starch before and after enzymatic hydrolysis at 60 ℃ for 3 h

綜合以上研究結(jié)果，Gt-amy可有效地結(jié)合和降解玉米淀粉，而其CTD缺失突變體Gt-amy-T不能結(jié)合和降解玉米淀粉。這表明，雖然CTD不屬于典型的SBD，但是CTD在Gt-amy結(jié)合和酶解玉米淀粉中發(fā)揮重要作用。

2.4 CTD中生淀粉結(jié)合位點(diǎn)的確定

圖 6 生淀粉結(jié)合位點(diǎn)突變體對(duì)玉米淀粉的結(jié)合Fig. 6 Corn starch binding capacities of raw starch binding site mutants

Gt-amy CTD可有效結(jié)合玉米淀粉，CTD中可能存在生淀粉結(jié)合位點(diǎn)。目前已知的SBD中參與生淀粉結(jié)合的芳香族氨基酸殘基均為色氨酸。為確定CTD中生淀粉結(jié)合位點(diǎn)，將CTD中色氨酸殘基Tyr定點(diǎn)突變?yōu)楸彼釟埢鵄la，并比較CTD與W→A定點(diǎn)突變體對(duì)玉米淀粉的結(jié)合。根據(jù)QuikChange?點(diǎn)突變?cè)噭┖械脑?，?gòu)建CTD的W→A定點(diǎn)突變體W471A、W501A、W514A、W526A、W533A、W540A、W548A，在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)各突變體，并采用Ni2+親和層析純化各突變體。如圖6所示，與CTD相比，突變體W526A和W540A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率基本不變，突變體W471A、W533A及W548A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率略有下降，突變體W501A和W514A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率明顯降低。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建雙位點(diǎn)突變體W501A/W514A，并檢測(cè)該突變體對(duì)玉米淀粉的結(jié)合。如圖6所示，突變體W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率顯著下降。根據(jù)以上研究結(jié)果，可以確定CTD中W501和W514可能是生淀粉結(jié)合位點(diǎn)。

2.5 重組蛋白質(zhì)Gt-amy及Gt-amy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率和降解率

圖 7 Gt-amy及突變體Gt-amy W501A/W514A的SDS-PAGE圖Fig. 7 SDS-PAGE analysis of Gt-amy and Gt-amy W501A/W514A

圖 8 生淀粉結(jié)合位點(diǎn)對(duì)玉米淀粉結(jié)合率（A）及降解率（B）的影響Fig. 8 Effect of raw starch-binding site on raw corn starch adsorption (A) and hydrolysis (B)

圖 9 玉米淀粉的掃描電鏡圖Fig. 9 SEM images of raw corn starch before and after enzymatic hydrolysis at 60 ℃ for 3 h

為確定生淀粉結(jié)合位點(diǎn)W501及W514對(duì)Gt-amy結(jié)合和降解玉米淀粉的影響，構(gòu)建突變體Gt-amy W501A/W514A，對(duì)Gt-amy W501A/W514A進(jìn)行表達(dá)與純化 （圖7），并比較Gt-amy及Gt-amy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率和降解率（圖8）。與Gt-amy相比，Gtamy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率和降解率均明顯降低。其中，當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/100 mL時(shí)，Gt-amy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的結(jié)合率為8.5%，約為Gt-amy的10.8%；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到180 min時(shí)， Gt-amy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的降解率為25.8%，約為Gt-amy的39.2%。此外，從玉米淀粉的掃描電鏡圖 （圖9）也可以看出，Gt-amy及Gt-amy W501A/W514A均可降解玉米淀粉，但是經(jīng)Gt-amy處理后的玉米淀粉殘留量較經(jīng)Gt-amy W501A/W514A處理后的玉米淀粉殘留量明顯偏少，這表明Gt-amy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的降解率明顯降低。以上結(jié)果表明，對(duì)Gt-amy CTD中生淀粉結(jié)合位點(diǎn)W501和W514進(jìn)行突變，影響Gt-amy對(duì)玉米淀粉的結(jié)合和酶解。

2.6 CTD和生淀粉結(jié)合位點(diǎn)W501、W514對(duì)Gt-amy催化活性的影響

比較Gt-amy、CTD缺失突變體Gt-amy-T以及生淀粉結(jié)合位點(diǎn)突變體Gt-amy W501A/W514A對(duì)可溶性淀粉和玉米淀粉的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以此確定CTD和生淀粉結(jié)合位點(diǎn)W501、W514對(duì)Gt-amy催化活性的影響。從表2可以看出，以可溶性淀粉為底物時(shí)，與Gt-amy相比， Gt-amy-T對(duì)可溶性淀粉的Km未明顯改變，kcat值明顯降低，即Gt-amy-T的可溶性淀粉結(jié)合能力未明顯改變，以可溶性淀粉為底物時(shí)的反應(yīng)速率明顯下降，約為Gt-amy的77.9%；Gt-amy W501A/W514A對(duì)可溶性淀粉的Km及kcat值均未明顯改變。以玉米淀粉為底物時(shí)，與Gt-amy相比，Gt-amy-T不能酶解玉米淀粉；Gt-amy W501A/W514A對(duì)玉米淀粉的Km提高至約4.2 倍，kcat值降低了55%，即Gt-amy W501A/W514A的玉米淀粉結(jié)合能力明顯降低，以玉米淀粉為底物時(shí)的反應(yīng)速率也明顯降低。以上研究結(jié)果表明，CTD的缺失突變不僅導(dǎo)致Gt-amy喪失酶解生淀粉的能力，還使其對(duì)可溶性淀粉的降解能力下降；生淀粉結(jié)合位點(diǎn)W501、W514的突變不影響Gt-amy對(duì)可溶性淀粉的催化活性，但影響Gt-amy對(duì)玉米淀粉的結(jié)合和酶解。

表 2 重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 2 Kinetic parameters of recombinant α-amylase

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，α-淀粉酶AmyP的SBD對(duì)其可溶性淀粉酶活影響顯著，SBD缺失突變體AmyPΔSBD的可溶性淀粉酶活下降了80%[32]。本研究CTD缺失突變體 Gt-amy-T的可溶性淀粉酶活力也低于Gt-amy。也有研究表明SBD的缺失不影響一些生淀粉酶的可溶性淀粉酶活力，如來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶[26]和來源于T. ethanolicus39E的淀粉普魯蘭酶[27]。此外，SBD的缺失有利于提高一些生淀粉酶的可溶性淀粉酶活力，如來源于B. thetaiotaomicron的α-淀粉酶SusG[25]和來源于Bacillussp. 195的α-淀粉酶[33]。SBD或生淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)Φ矸勖傅目扇苄缘矸勖富盍Ξa(chǎn)生不同影響，可能原因是該結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的變化。

3 結(jié) 論

本研究通過分析Gt-amy、CTD缺失突變體Gt-amy-T和生淀粉結(jié)合位點(diǎn)突變體Gt-amy W501A/W514A的玉米淀粉結(jié)合率和降解率，確定了CTD的功能和CTD中生淀粉結(jié)合位點(diǎn)。CTD屬于生淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在Gt-amy結(jié)合和酶解生淀粉中發(fā)揮重要作用，并且CTD影響Gt-amy的可溶性淀粉酶活力，CTD有利于Gt-amy發(fā)揮可溶性淀粉酶活力；CTD中氨基酸位點(diǎn)W501和W514可能是生淀粉結(jié)合位點(diǎn)，參與生淀粉結(jié)合。Gt-amy CTD不屬于典型的SBD，卻具有生淀粉結(jié)合能力，并對(duì)Gt-amy的酶學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。本研究不僅拓展了對(duì)生淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能的了解，也為其他α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)化提供新的理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。