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    平貝母多糖鐵配合物的合成、結構特征及 抗氧化活性

    2020-04-02 03:31:58徐少博王宇亮趙芷萌孟繁玲
    食品科學 2020年6期
    關鍵詞:清除率自由基多糖

    張 曼,張 宇,,徐少博,趙 宏,王宇亮,趙芷萌,孟繁玲

    (1.黑龍江省新藥創(chuàng)制與藥效毒理評價重點實驗室,佳木斯大學藥學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.黑龍江省第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150010)

    平貝母(Fritillaria ussuriensisMaxim.)又名坪貝、北貝、東北貝母、燈籠花,為百合科平貝母的干燥鱗莖[1-2]。 我國野生平貝母主要分布于東北地區(qū)長白山脈和小興安嶺南部山區(qū),海拔1 000 m以下的濕潤山腳坡地闊葉林帶及河谷兩岸[3]。研究表明,平貝母中含有多糖類、生物堿類、核苷類、皂苷類等多種有效成分[4-7]。多糖是藥用植物最重要的活性成分之一,具有抗氧化、抗衰老、降血糖等生物活性[8-10]。

    在人體生命活動中,氧化反應是參與體內代謝過程的重要環(huán)節(jié),氧作為最終電子受體,與未成對電子結合時就產(chǎn)生了自由基,自由基對人體的損傷主要有3 個方面:破壞細胞膜、血清抗蛋白酶失活、受損基因導致細胞突變率增加[11]。研究表明,人體內多種疾病的發(fā)生都與氧化損傷存在很大關系,隨著年齡的增長,機體對自由基的清除能力逐漸下降,從而導致機體 衰老[12]。近年來國內外學者研究發(fā)現(xiàn),多糖作為安全性高、無毒副作用新型的天然抗氧化劑的同時,亦可作為重要的大分子載體,與Fe3+絡合后形成穩(wěn)定的鐵配合物,這類配合物具有顯著增強的抗氧化活性[13]。王明等[14]研究發(fā)現(xiàn),枸杞多糖鐵的抗氧化能力顯著高于枸杞多糖。萬真真等[15]研究表明,大豆多糖鐵配合物不僅溶解性增強,還可以提高清除亞硝酸鹽自由基和抑制脂質過氧化的能力。迄今為止,對平貝母多糖(F. ussuriensis polysaccharide,F(xiàn)UP)的研究主要集中于提取分離[16]等方面,關于其多糖鐵配合物的研究鮮見報道。

    因此,本實驗以FUP為原料,與三氯化鐵絡合形成FUP鐵配合物(FUP-Fe),采用紫外-可見光譜、紅外光譜、X-射線粉末衍射、掃描電鏡、熱重-差熱分析等對FUP及FUP-Fe的結構進行表征和分析,并對FUP及其鐵配合物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力進行研究,為FUP抗氧化劑開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    平貝母于2018年9月購自哈藥集團世一堂中藥飲片有限責任公司,產(chǎn)品批號:1705005s。

    透析袋(截留分子質量3 500 Da) 上海源葉生物科技有限公司;檸檬酸三鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉、鄰苯三酚、水楊酸(均為分析純) 阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、硫酸亞鐵、過氧化氫均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設備

    DL-5-B低速多管離心機 上海安亭科學儀器廠;FA2004N型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司; HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司;FDU-1200型冷凍干燥機 日本東京理化株式會社; RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;GBC10紫外-可見分光光度計 澳大利亞GBC科學儀器公司;AVATAR380傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱電尼高力儀器公司;Rigaku MiniFlex600粉末衍射儀 日本理學 公司;Phenom ProX掃描電鏡 荷蘭飛納公司;TGS-1B熱重分析儀 瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

    1.3 方法

    1.3.1 FUP的提取與脫蛋白

    取平貝母藥材,經(jīng)機械粉碎后,過80 目篩得粗粉,經(jīng)石油醚回流脫脂5 h,在25 ℃抽濾并在揮干溶劑后,得到脫脂后的平貝母粉。稱取脫脂后的平貝母粉50.0 g,加入500 mL雙蒸水80 ℃浸提3 h,在此條件下加熱提取2 次,過8 層紗布合并2 次水提取液,減壓濃縮,加入5 倍體積的無水乙醇,使乙醇溶液體積分數(shù)達到85%,靜置24 h,離心(25 ℃、4 000 r/min、15 min)收集沉淀,45 ℃真空干燥,即得FUP。配制10%的FUP溶液,加入1/4體積的Sevag試劑(三氯甲烷-正丁醇,4∶1,V/V)充分振蕩20 min,離心(25 ℃、4 000 r/min、15 min),保留上清液,透析48 h,重復上述操作5 次[17]。

    1.3.2 FUP-Fe的制備

    稱取1.0 g脫蛋白后的FUP,溶于100 mL雙蒸水中,不斷攪拌使多糖充分溶解,加入檸檬酸三鈉0.5 g,80 ℃油浴下,緩慢滴加2 mol/L FeCl3溶液,并用20% NaOH溶液調節(jié)溶液pH值為8.5,當反應溶液中生成棕紅色沉淀時,立即停止滴加NaOH和FeCl3溶液,80 ℃條件下維持攪拌1.5 h(pH 8.5),待反應完成后離心(25 ℃、4 000 r/min、15 min),取上層溶液,加入5 倍體積的無水乙醇,得到紅棕色沉淀,45 ℃真空干燥后,即得FUP-Fe[18]。

    1.3.3 FUP及FUP-Fe理化性質測定

    1.3.3.1 定性鑒別

    參照文獻[19]中Fe3+的鑒別方法,進行定性鑒別實驗。

    1.3.3.2 紫外-可見光譜分析

    分別配制0.1 mg/mL的FUP和FUP-Fe的多糖溶液,以雙蒸水作為空白,用紫外-可見分光光度計進行掃描檢測,波長范圍為200~800 nm。

    1.3.3.3 紅外光譜分析

    取脫蛋白FUP與FUP-Fe各2 mg,按1∶1比例與KBr混合壓片,使用紅外光譜儀在4 000~400 cm-1范圍內進行光譜掃描[20]。

    1.3.3.4 X-射線粉末衍射分析

    將樣品鋪在樣品板上,用載玻片壓實后,置于X-射線粉末衍射儀中,采用石墨單色化Cu-Kα輻射(λ=0.154 nm),2θ測試范圍為5°~50°,掃描速 率為6°/min[21]。

    1.3.3.5 掃描電鏡和能譜分析

    將樣品粉末鋪到導電膠上,并用洗耳球將沒有黏在導電膠上的樣品吹掉,將導電膠置于樣品臺中,在加速電壓為15 kV的掃描電子顯微鏡中進行測試,分析其形貌特征和相應的能譜[22]。

    1.3.3.6 熱重-差熱分析

    分別稱取10.0 mg的FUP和FUP-Fe,以N2為保護氣,流量50 mL/min,溫度由室溫升至700 ℃,升溫速率為10 ℃/min,進行熱重和差熱分析。以溫度為X軸,以質量損失率為Y軸,繪制熱重分析曲線;以溫度為X軸,以溫度差為Y軸,繪制差熱分析曲線[23]。

    1.3.4 體外抗氧化測定

    1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

    參照文獻[24]的方法。精密稱取0.8 mg DPPH溶于20 mL無水乙醇中,即配制質量濃度為0.04 mg/mL DPPH-乙醇溶液。分別移取6 組不同質量濃度(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)的FUP溶液和FUP-Fe溶液70 μL,再加入180 μL DPPH溶液,于27 ℃避光反應5 min,在517 nm波長處測定吸光度。以不含多糖樣品的DPPH溶液為空白對照組,以同質量濃度VC溶液作為陽性對照組。按式(1)計算DPPH自由基清除率:

    式中:Ao為空白對照溶液的吸光度;Ai為加入樣品后吸光度。

    1.3.4.2 超氧陰離子自由基的清除活性測定

    在文獻[25]的方法基礎上,略作修改。配制6 組不同質量濃度的多糖溶液(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL), 取0.2 mL FUP溶液和FUP-Fe溶液,向其加入3 mL 0.05 mL/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)于試管中,渦旋混勻15 s,25 ℃反應10 min,在此溫度下,加入12 μL 30 mmol/L鄰苯三酚溶液反應4 min,在320 nm波長處測定吸光度。用雙蒸水調零,以同質量濃度VC溶液作為陽性對照組。按式(2)計算超氧陰離子自由基清除率:

    式中:Ao為空白對照溶液的吸光度;Ai為加入樣品后的吸光度;Ab為Tris-HCl緩沖液的吸光度。

    1.3.4.3 羥自由基清除能力的測定

    參照文獻[26]的方法進行測定。在試管中分別加入不同質量濃度的(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、 3.2 mg/mL)FUP溶液和FUP-Fe溶液1 mL,依次加入7.5 mol/L硫酸亞鐵溶液1.5 mL,8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液3 mL,7.5 mmol/L過氧化氫溶液3 mL,渦旋混合1 min,37 ℃反應45 min,在510 nm波長處測定吸光度。用雙蒸水調零,以同質量濃度VC溶液作為陽性對照組。清除率計算同式(1)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    以上實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 9.1軟件處理繪圖。

    2 結果與分析

    2.1 FUP提取結果

    平貝母經(jīng)水提醇沉后得到FUP,提取率為4.66%。

    2.2 定性鑒別結果

    FUP在堿性條件下與Fe3+絡合形成FUP-Fe,在此條件下可能生成Fe(OH)3,需要將Fe(OH)3與FUP-Fe溶液進行定性鑒別比較。結果顯示,F(xiàn)UP-Fe溶液中并未檢測到游離的Fe3+,表明FUP與Fe3+成功絡合,定性鑒別結 果見表1。

    表 1 FUP-Fe定性鑒別結果Table 1 Qualitative identification of FUP-Fe complex

    2.3 紫外-可見光譜分析結果

    圖 1 FUP和FUP-Fe紫外掃描圖譜Fig. 1 UV-Vis absorption spectra of FUP and FUP-Fe complex

    由圖1可知,通過紫外分光光度計200~800 nm進行全譜掃描,在波長260 nm和280 nm處未觀察到任何吸收峰,說明FUP和FUP-Fe不含有核酸、蛋白質等物質,Sevag法將此類物質基本除凈[27]。圖1顯示,F(xiàn)UP-Fe吸收峰明顯高于FUP,推測多糖結構中的羥基參與了絡合反應。

    2.4 紅外光譜分析結果

    圖 2 FUP和FUP-Fe紅外圖譜Fig. 2 IR spectra of FUP and FUP-Fe complex

    由圖2可知,F(xiàn)UP中在3 414 cm-1處出現(xiàn)的寬峰是—OH伸縮振動的特征吸收峰。由于多糖分子具有許多羥基,分子內和分子間氫鍵的形成使其峰值特別寬。在FUP-Fe中此峰向高波數(shù)移至3 511 cm-1。FUP中2 929 cm-1為C—H伸縮振動吸收峰,在FUP-Fe中此峰移至2 932 cm-1;FUP中1 636、1 424 cm-1分別為C=O伸縮振動吸收峰和—OH彎曲振動吸收峰;而多糖結構修飾后吸收峰分別向低波數(shù)移至1 601、1 397 cm-1, FUP-Fe發(fā)生了明顯的紅移,說明多糖結構中—OH和C=O參與絡合反應。FUP結構修飾前后,紅外圖譜中特殊吸收峰未發(fā)生明顯變化,說明形成配合物后,多糖基本骨架結構未被破壞。吡喃環(huán)結構的C—O吸收峰為1 015 cm-1;α-吡喃環(huán)中C—H的變角振動吸收峰為851 cm-1;761 cm-1為D-葡萄糖環(huán)的C—O—C振動引起的吸收峰[28]。因此,說明FUP糖鏈由吡喃糖組成。

    2.5 X-射線粉末衍射分析結果

    圖 3 FUP和FUP-Fe的X-射線粉末衍射圖譜Fig. 3 XRD patterns of FUP and FUP-Fe complex

    由圖3可知,多糖結構修飾前后圖譜基本一致,只是峰的強度略有差別,說明形成配合物后,未破壞多糖結構的基本骨架,X-射線粉末衍射分析結果與紅外圖譜分析結果基本一致。此外,F(xiàn)UP和FUP-Fe沒有呈晶體的趨勢,屬于無定型結構。

    2.6 掃描電鏡和能譜分析結果

    圖 4 FUP和FUP-Fe掃描電鏡圖譜Fig. 4 SEM images of FUP and FUP-Fe complex

    圖4 顯示,從表面形貌看,F(xiàn)UP表面粗糙,裂紋明顯,顆粒排列松散,有很多細小空隙,與鐵離子配位后,F(xiàn)UP-Fe呈片狀,表面光滑,顆粒排列緊密,空隙較少,說明FUP與Fe3+形成了配合物。從均勻程度看,F(xiàn)UP結構修飾前,多糖顆粒大小不均,與Fe3+絡合后,配合物多糖顆粒大小比較均一。由圖5及表2可知,多糖經(jīng)修飾后,C、O含量均有降低,F(xiàn)e相對原子含量約為6.45%。且各元素分布均一,進一步證實了多糖鐵配合物的成功制備,形成穩(wěn)定的FUP-Fe。

    圖 5 FUP(a)和FUP-Fe(b)能譜及元素衍射圖譜Fig. 5 Energy dispersion spectra and corresponding elemental mappings of FUP (a) and FUP-Fe complex (b)

    表 2 FUP和FUP-Fe元素含量Table 2 Element contents of FUP and FUP-Fe complex

    2.7 熱重-差熱分析結果

    從圖6 A 可以看出,F(xiàn) U P 熱分解的第1 階段為30~170 ℃(質量損失率3.339%),此階段損失的主要是水,熱分解的第2階段為170~700 ℃(質量損失率48.15%),在170~500 ℃質量損失速度增快,說明此時多糖的化學鍵被破壞,多糖已被分解。從圖6B可以看出,F(xiàn)UP-Fe熱分解的第1階段為30~160 ℃(質量損失率1.192%),此階段損失的主要是水,熱分解的第2階段為160~700 ℃(質量損失率61.81%),在160~570 ℃質量損失速度增快,說明此時多糖配合物的化學鍵被破壞,多糖配合物已被分解。比較可知,溫度分別為500、570 ℃,質量損失速度減慢,說明FUP-Fe比FUP結構更穩(wěn)定。從圖6可知,在200~600 ℃之間,屬于2 種多糖分子結構中的分解反應,消除多糖中的羥基分子降解。FUP經(jīng)393.6 ℃和441.8 ℃ 2 個吸熱反應,683.0 ℃一個放熱反應而分解;FUP-Fe經(jīng)345.7 ℃和552.9 ℃ 2 個吸熱反應,583.1 ℃一個放熱反應分解[29]。這說明二者多糖結構存在差異,根據(jù)吸熱分解溫度看,多糖穩(wěn)定性順序為 FUP-Fe大于FUP。

    圖 6 FUP(A)和FUP-Fe(B)熱重-差熱曲線圖Fig. 6 TGA-DTA curves of FUP (A) and FUP-Fe complex (B)

    2.8 體外抗氧化分析結果

    圖 7 FUP和FUP-Fe抗氧化能力Fig. 7 Antioxidant capacities of FUP and FUP-Fe complex

    由圖7A可知,F(xiàn)UP的DPPH自由基清除活性明顯低于FUP-Fe的清除活性。隨著多糖質量濃度的增加,F(xiàn)UP-Fe對DPPH自由基清除率逐漸增強,當質量濃度為 8 mg/mL時,清除率高達68.96%。質量濃度范圍在0~4 mg/mL時,隨著FUP質量濃度的增加,清除率也隨之增強,在4~8 mg/mL范圍內,清除率基本維持在48.46%。這表明FUP-Fe能顯著提高對DPPH自由基的清除能力。

    由圖7B可知,質量濃度在1~8 mg/mL范圍內,VC對超氧陰離子自由基的清除效果仍然是最佳,F(xiàn)UP的清除效果最差。在0.5~8 mg/mL范圍FUP和FUP-Fe 的清除率隨著質量濃度的增加而增強,質量濃度為 8 mg/mL時,達到最大清除率分別為30.58%和57.28%。這表明,F(xiàn)e3+的引入對超氧陰離子自由基有顯著的清除作用。

    由圖7C可知,不同質量濃度的FUP和FUP-Fe對羥自由基具有的清除作用??偟膩碚f,隨著多糖質量濃度的增加,羥自由基的清除率隨之增加,有明顯的上升趨勢。此外,F(xiàn)UP-Fe清除羥自由基的能力遠強于FUP,F(xiàn)UP-Fe對羥自由基清除率可高達46.88%。

    實驗表明,在體外中許多多糖自身具有一定的抗氧化活性,經(jīng)與Fe3+絡合后的多糖,抗氧化能力顯著增加,但均低于陽性對照VC對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率。景永帥等[30]合成北沙參多糖鐵配合物,并對抗氧化活性進行研究,結果表明多糖經(jīng)鐵修飾后,抗氧化活性顯著增加,這與本實驗結果一致。這可能由于多糖分子結構中有游離的—OH,引入Fe3+后,多糖羥基暴露增加,有利于捕捉自由基,從而增加其抗氧化活性[31]。

    3 結 論

    多糖中的醇羥基可以與金屬離子(如Fe3+)絡合,形成穩(wěn)定的多糖鐵配合物,配糖基為Fe3+,不是以游離的鐵離子形式存在,可以有效地避免對生物機體的胃腸道功能刺激作用,在機體內代謝還原成Fe2+,提高生物利用度,促進在胃腸道內的消化吸收,毒副作用小。此外,還可以有效地預防治療缺鐵性貧血癥。

    因此,本研究以FUP為原料,與三氯化鐵絡合形成FUP-Fe,對FUP結構進行修飾。通過定性實驗、紫外-可見光譜、紅外光譜、X-射線粉末衍射、掃描電鏡、能譜和熱重-差熱分析等表征手段對FUP及FUP-Fe的理化性質和結構特征進行研究。結果顯示,F(xiàn)UP與Fe3+成功絡合,形成了穩(wěn)定的配合物,且其穩(wěn)定性顯著高于FUP的穩(wěn)定性。進一步對FUP及FUP-Fe的抗氧化能力測定,結果表明,F(xiàn)UP-Fe對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基有清除作用且均強于FUP。綜上所述,F(xiàn)UP經(jīng)結構修飾后,由于鐵離子的引入,可顯著提高結構穩(wěn)定性和抗氧化能力。為FUP-Fe的進一步研究提供了有效的基礎,為體內抗氧化活性提供了有效的理論依據(jù)。此外,有望開發(fā)FUP-Fe為新型保健功能的補鐵劑。

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