丙二醛氧化修飾對白鰱肌原纖維蛋白 結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

蔣祎人，李 濤，劉友明,，熊善柏

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）作為我國重要的養(yǎng)殖淡水魚品種，是淡水魚糜加工的主要魚種。白鰱魚肉中富含營養(yǎng)價值較高的不飽和脂肪酸，魚糜漂洗過程中未能完全去除魚肉中的脂肪，導(dǎo)致魚糜在凍藏過程中易發(fā)生脂肪氧化，同時脂肪氧化過程中生成的自由基及次級產(chǎn)物均會引發(fā)蛋白質(zhì)氧化，從而引起蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生改變[1]。

丙二醛是脂肪氧化主要的次級產(chǎn)物之一，其含量可用來衡量脂肪氧化的程度。丙二醛不僅可以氧化蛋白質(zhì)的側(cè)鏈和多肽骨架，造成蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，從而改變其功能特性，還可以與氨基酸基團反應(yīng)，生成席夫堿導(dǎo)致分子間聚合物的生成[2-5]。已研究表明，較為溫和的氧化條件可適當(dāng)提高植物蛋白的功能性質(zhì)，但氧化過度會導(dǎo)致功能特性下降[6-7]。動物蛋白經(jīng)過丙二醛氧化改性后，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。一般來說，氧化程度增加會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的α-螺旋含量下降，無規(guī)卷曲含量上升[8]。 白鰱肌原纖維蛋白經(jīng)丙二醛誘導(dǎo)氧化后蛋白的溶解性下降，而且氧化程度增加可使白鰱魚糜流動性降低，無法進行擠壓式3D打印[9]。適宜濃度的丙二醛可引起蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，產(chǎn)生共價交聯(lián)，從而促進蛋白質(zhì)熱凝膠形成能力、凝膠強度和凝膠持水性增強[10]。目前從脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化的角度闡述白鰱魚糜品質(zhì)變化規(guī)律的研究較少。研究氧化應(yīng)激環(huán)境中白鰱肌原纖維蛋白的響應(yīng)機制可有助于理解白鰱魚糜在凍藏過程中品質(zhì)變化的分子機理。本實驗以低濃度的丙二醛溶液作為氧化體系，對白鰱肌原纖維蛋白進行氧化，通過分析氧化前后白鰱肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)特性變化，探究脂質(zhì)氧化次級產(chǎn)物中的小分子醛類對魚肉主要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律，以期為魚糜凍藏過程中品質(zhì)變化的量化檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白鰱，體質(zhì)量2～3 kg/條，春季購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場，冰水保鮮快速運至實驗室，清洗干凈后去除頭尾和內(nèi)臟，取背部肌肉用于提取肌原纖維蛋白。

氯化鈉、磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉、尿素、三氯乙酸、 乙二胺四乙酸、 2 , 4 - 二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、二硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（均為分 析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；1,1,3,3-四甲氧基丙烷（1,1,3,3-tetramethoxypropane，TMP）、三羥甲基氨基甲烷（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K600食品料理儀 德國博朗電器公司；722N型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；Avanti J-26XP冷凍離心機 美國貝克曼公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機 上海標(biāo)本模型廠；F-4600熒光分光光度計 日本島津公司；Bio-Rad電泳儀 美國博樂公司；J-1500圓二色譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考Huang Jingjing等[11]的方法提取白鰱肌原纖維蛋白并略作改動。從新鮮宰殺的白鰱背部采集魚肉，然后用4 倍體積的低鹽磷酸緩沖液（20 mmol/L、0.05 mol/L NaCl、pH 7.5）漂洗3 次，得到的沉淀與4 倍體積的高鹽磷酸緩沖液（20 mmol/L、0.45 mol/L NaCl、pH 7.5）混合均勻，4 ℃靜提過夜（22 h）。將混合物進行離心（12 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清液，加入10 倍體積的冷凝水，靜置30 min后離心（10 000 r/min、10 min、4 ℃），除去上清液，得到的沉淀即為肌原纖維蛋白，于4 ℃存放備用。用福林-酚法測量蛋白濃度[12]。

1.3.2 丙二醛溶液的制備

參考Wang Lin等[13]的方法配制丙二醛溶液，并略作改動。將8.4 mL TMP溶于10 mL 5 mol/L鹽酸中用純水定容至50 mL后，將溶液置于40 ℃水浴鍋中避光水浴振蕩30 min，直至深黃色生成。然后用6 mol/L NaOH調(diào)溶液pH值為6.0，最后將丙二醛原儲液用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）定容至250 mL。丙二醛濃度用紫外分光光度計測定：將丙二醛溶液稀釋105倍后在波長267 nm（堿液，ε=31 500）處測定吸光度，從而計算濃度。將丙二醛儲備液避光低溫保存。

1.3.3 肌原纖維蛋白的氧化

向質(zhì)量濃度為40 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液中加入不同濃度的丙二醛（0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mmol/L），在25 ℃條件下避光反應(yīng)24 h，得到不同氧化程度的肌原纖維蛋白樣品。

1.3.4 羰基含量的測定

參考Mesquita等[14]的方法，略作改動。400 μL 10 mmol/L DNPH（含有0.5 mol/L H3PO4）加入400 μL蛋白質(zhì)溶液（2 mg/mL）混合均勻。混合液室溫反應(yīng)10 min后，加入200 μL NaOH溶液（6 mol/L），繼續(xù)在室溫下反應(yīng)10 min，于450 nm波長處測定吸光度，以消光系數(shù)22 308 L/（mol·cm）計算蛋白羰基衍生物含量。

1.3.5 二聚酪氨酸含量的測定

參考Davies等[15]的方法進行測定。測量條件：發(fā)射波長420 nm，激發(fā)波長325 nm，狹縫寬度均為10 nm。二聚酪氨酸含量用相對熒光值表示。

1.3.6 巰基含量的測定

參考Ellman[16]的方法進行測定。測定活性巰基含量時，向1 mL肌原纖維蛋白溶液（2～4 mg/mL）中加入9 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（含2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、10 mmol/L EDTA，pH 6.8）和1 mL Ellman試劑（含0.1% DTNB、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），混勻后于4 ℃恒溫放置1 h，測其在412 nm波長處的吸光度。

測定總巰基含量時，向1 mL肌原纖維蛋白溶液（2～4 mg/mL）中加入9 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（含8 mol/L尿素、2% SDS、10 mmol/L EDTA，pH 6.8）和1 mL Ellman試劑混合均勻，40 ℃水浴25 min，測其在412 nm波長處的吸光度。

1.3.7 游離氨基含量的測定

參考馮巖等[17]的方法，略作修改。鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）試劑的配制：準確稱取40 mg OPA溶解于1 mL甲醇中，分別加入2.5 mL 20%的SDS，25 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液，100 μL β-巰基乙醇，用蒸餾水定容到50 mL，此為OPA試劑，且使用前即時配制。取200 μL蛋白樣品（2 mg/mL）加入4 mL OPA試劑，混勻后于35 ℃反應(yīng)2 min，在340 nm波長處測定吸光度。以L-亮氨酸制作標(biāo)準曲線，計算樣品中游離氨基含量。

1.3.8 表面疏水性的測定

參考Yongsawatdigul等[18]的方法，略作修改。蛋白疏水性采用1-苯胺基-8-萘基磺酸鹽（8-anilino-1-naphthalenesulphonic acid，ANS）熒光測定法。用緩沖液（0.6 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）將不同氧化程度的肌原纖維蛋白稀釋為0.05、0.1、0.15 mg/mL和0.2 mg/mL。取 4 mL稀釋的蛋白溶液與 20 μL 8 mmol/L ANS溶液混勻，避光反應(yīng)10 min后測量熒光強度。測量時激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm。以相對熒光強度對蛋白質(zhì)濃度的斜率作為表面疏水性。

1.3.9 Ca2+-ATPase活性的測定

參考Benjakul等[19]的方法，略作修改。向3.5 mL肌原纖維蛋白溶液（2 mg/mL）中加入 0.3 mL Trismaleat溶液（0.5 mol/L，pH 7.0），0.5 mL CaCl2溶液（0.1 mol/L），25 ℃水浴恒溫后，加入0.25 mL 20 mmol/L ATP溶液，在25 ℃反應(yīng)10 min后用2.5 mL 15%三氯乙酸阻斷反應(yīng)。反應(yīng)液離心后（6 5 0 0 r/m i n、5 min）得上清液?？瞻捉M中三氯乙酸和ATP添加順序調(diào)換。采用鉬酸銨法測定反應(yīng)釋放出無機磷含量， Ca2+-ATPase活性以1 mg蛋白在1 min內(nèi)生成的無機磷含量 計，以μmol/（mg·min）表示。

1.3.10 溶解性的測定

取5 mL蛋白樣品離心（8 000×g、10 min、4 ℃），采用福林-酚法[12]測定上清液的蛋白質(zhì)濃度。溶解度表示為離心后的蛋白質(zhì)濃度與離心前蛋白質(zhì)濃度的百分比。

1.3.11 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參考Xiong Youling等[20]的方法，略作修改。不同氧化程度的肌原纖維蛋白與含有（不含有）5% β-ME的樣品緩沖液（4% SDS、10% β-ME、2%甘油、0.5%溴酚藍，pH 6.8）混合，將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至1.0 mg/mL。用10%分離膠，4%濃縮膠。電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（含0.1% SDS，pH 8.3），用考馬斯亮藍R-250染色液（含0.15%考馬斯亮藍R-250、50%乙醇、10%冰醋酸）進行染色；用含50%乙醇、10%冰醋酸的洗脫液進行脫色。

1.3.12 圓二色譜測度

參考Wang Zhaoming等[21]的方法，略作修改。將肌原纖維蛋白溶液樣品稀釋至1 mg/mL，放入0.1 cm光徑的石英樣品池中，在遠紫外區(qū)（波長范圍190～250 nm）進行掃描，掃描速率為100 nm/min，測定溫度為20 ℃。殘基平均摩爾質(zhì)量為110 g/mol，采用楊氏模量模擬計算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲二級結(jié)構(gòu)相對含量。圓二色性用平均殘基橢圓值θ表示，單位 為（deg·cm2）/dmol。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0和Excel軟件作圖，運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性及顯著性分析（P＜0.05，顯著水平）。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白羰基含量的影響

如圖1所示，經(jīng)丙二醛氧化后的肌原纖維蛋白中羰基的含量顯著高于未添加的對照組（P＜0.05），說明丙二醛氧化導(dǎo)致肌原纖維蛋白的羰基含量增加。低濃度的丙二醛（0.05～0.50 mmol/L）濃度變化與肌原纖維蛋白羰基含量之間的量效關(guān)系不顯著（P≥0.05），而高濃度丙二醛（1.00 mmol/L）使羰基含量顯著增加（P＜0.05），此時蛋白質(zhì)氧化程度明顯增加。羰基的主要產(chǎn)生途徑是敏感性氨基酸側(cè)鏈的直接氧化以及肽鍵的斷裂[22]，實驗中丙二醛濃度在0.05～0.50 mmol/L范圍內(nèi)羰基含量的變化不顯著，表明此濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生的氧化未大量攻擊敏感性氨基酸側(cè)鏈和肽鍵，屬于輕度氧化。

圖 1 丙二醛濃度對白鰱肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of MDA concentration on the carbonyl content of myofibrillar protein from silver carp

2.2 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

圖 2 丙二醛濃度對肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig. 2 Effect of MDA concentration on dityrosine content of myofibrillar protein from silver carp

由圖2可知，在較低濃度丙二醛（≤0.25 mmol/L）氧化應(yīng)激環(huán)境中，白鰱肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量無顯著性變化（P≥0.05），丙二醛濃度達0.50 mmol/L時，二聚酪氨酸含量顯著增加（P＜0.05）。這可能是在低濃度的丙二醛條件下，蛋白氧化程度較輕，蛋白空間結(jié)構(gòu)比較完整和穩(wěn)定，丙二醛不易攻擊氨基酸側(cè)鏈，產(chǎn)生的酪氨酰自由基和酪氨酸殘基數(shù)量較少[23]；當(dāng)丙二醛濃度增加到0.50 mmol/L，氨基酸側(cè)鏈遭到攻擊的機會增多，酪氨酸單體被氧化的幾率更大，迅速與其周圍其他蛋白的酪氨酸殘基產(chǎn)生了共價交聯(lián)，因此形成了較多的酪氨酸二聚體[24]。

2.3 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響

如圖3 所示，總巰基含量在丙二醛濃度較低（≤0.25 mmol/L）時沒有顯著性變化，隨著濃度進一步增加，總巰基含量開始下降?；钚詭€基的含量呈現(xiàn)先上升后下降的量效關(guān)系，丙二醛濃度為0.25 mmol/L時活性巰基的含量增加至1.02 μmol/g。蛋白質(zhì)發(fā)生輕度氧化時，分子結(jié)構(gòu)展開，構(gòu)象發(fā)生變化，原本包埋在內(nèi)部的巰基暴露出來使檢測到的活性巰基含量上升，但丙二醛濃度高于0.25 mmol/L后總巰基和活性巰基含量均有所下降，可能是由于暴露的巰基基團遭到氧化攻擊，形成了磺酸或二硫鍵等相關(guān)化合物[25]?；钚詭€基含量與ATPase活性、疏水相互作用和膠凝過程中二硫鍵的形成有密切關(guān)系，在魚糜熱凝膠形成過程中，肌原纖維蛋白氧化后活性巰基含量的上升可促進魚糜凝膠強度的增加[26]。

圖 3 丙二醛濃度對肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響Fig. 3 Effect of MDA concentration on total thiol and active thiol contents of myofibrillar protein from silver carp

2.4 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白游離氨基含量的影響

圖 4 丙二醛濃度對肌原纖維蛋白游離氨基含量的影響Fig. 4 Effect of MDA concentration on free amino group content of myofibrillar protein from silver carp

如圖4所示，丙二醛濃度低于0.50 mmol/L時游離氨基含量無顯著差異（P≥0.05），丙二醛濃度達到1.00 mmol/L時游離氨基顯著降低（P＜0.05）。蛋白發(fā)生氧化時，氨基酸側(cè)鏈中的NH—或NH2基團可能會受到自由基攻擊產(chǎn)生羰基衍生物，實驗結(jié)果表明，丙二醛濃度較低時，氨基酸側(cè)鏈上的氨基基團未受到大范圍攻擊，丙二醛濃度上升到1.00 mmol/L，游離氨基的減少可能是因為丙二醛分子中的羰基可直接與氨基酸側(cè)鏈的氨基發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)，進而降低了肌原纖維蛋白的游離氨基含量。

2.5 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性的變化反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，蛋白質(zhì)中非極性氨基酸暴露會導(dǎo)致表面疏水性增強[27]。如圖5所示，隨著丙二醛濃度的增加，肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著升高（P＜0.05），表明丙二醛誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化可以促進蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開，蛋白質(zhì)內(nèi)部的大量非極性位點暴露于蛋白表面，導(dǎo)致表面疏水性的上升，這與活性巰基含量上升的結(jié)果一致（圖3）。疏水基團的暴露是蛋白形成聚集體的前提，可促進蛋白質(zhì)分子分子間的物理和化學(xué)交聯(lián)，從而有利于魚糜凝膠形成能力的增強[28-29]。

圖 5 丙二醛濃度對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 5 Effect of MDA concentration on surface hydrophobicity of myofibrillar protein from silver carp

2.6 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

圖 6 丙二醛濃度對肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性的影響Fig. 6 Effect of malondialdehyde concentration on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein from silver carp

如圖6所示，隨著丙二醛濃度的上升，Ca2+-ATPase活性呈先下降后上升的趨勢。丙二醛濃度達到0.10 mmol/L 時，Ca2+-ATPase活性由0.056 7 μmol/（mg·min）降至0.042 5 μmol/（mg·min），丙二醛濃度增加到0.25 mmol/L， Ca2+-ATPase有所升高。肌球蛋白的頭部S1區(qū)的2 個活性巰基SH1和SH2與Ca2+-ATPase的活性密切相關(guān)，適度的蛋白氧化可提高Ca2+-ATPase的活性[26,30]。當(dāng)丙二醛濃度較低時（≤0.10 mmol/L），肌球蛋白頭部活性位點的巰基基團遭到了氧化攻擊，導(dǎo)致Ca2+-ATPase的活性下降；丙二醛濃度上升至0.25～1.00 mmol/L范圍，Ca2+-ATPase的活性升高，推測可能是因為蛋白氧化造成了肌球蛋白頭部S1區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，導(dǎo)致酶活上升，但具體原因還需進行進一步研究。

2.7 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白溶解度的影響

如圖7所示，隨著丙二醛濃度的上升，蛋白溶解度呈現(xiàn)下降的變化趨勢，對照組的蛋白溶解度為94.76%，丙二醛濃度上升到1.00 mmol/L后，蛋白溶解度下降至47.75%。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間的相互作用會影響蛋白質(zhì)的溶解度[2]。蛋白溶解度的下降可能是因為隨著丙二醛濃度增加，蛋白氧化程度增加，導(dǎo)致了表面疏水性的增加（圖5），產(chǎn)生了聚集體，進而造成蛋白溶解度的降低。

圖 7 丙二醛濃度對肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig. 7 Effect of MDA concentration on solubility of myofibrillar protein from silver carp

2.8 SDS-PAGE分析

圖 8 經(jīng)丙二醛氧化修飾后的肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 8 SDS-PAGE pattern of silver carp myofibrillar protein after oxidative modification with MDA

如圖8a所示，肌球蛋白重鏈是肌原纖維蛋白的主要片段[31]，此外還有少量的肌動球蛋白和肌球蛋白輕鏈。隨著丙二醛濃度的增加，在圖8b中肌球蛋白重鏈條帶強度沒有明顯降低且沒有產(chǎn)生新的可見條帶，這可能表示蛋白的氧化程度較輕，未能引起肌球蛋白重鏈的斷裂。

由圖8a可以看出，經(jīng)過丙二醛氧化修飾后，肌球蛋白重鏈上方區(qū)域產(chǎn)生了少量高分子化合物，并有部分堆積在進樣口無法進入濃縮膠，且隨著丙二醛濃度的升高條帶逐漸變深，表明蛋白質(zhì)經(jīng)氧化修飾會發(fā)生交聯(lián)或聚集形成聚集體。β-巰基乙醇是一種還原劑，能夠打斷二硫鍵。從圖8b可以看出，添加了β-巰基乙醇后，肌球蛋白重鏈上方區(qū)域的條帶消失，表明巰基氧化形成了二硫鍵，且二硫鍵是主要的交聯(lián)方式，但丙二醛濃度為1.00 mmol/L的還原性電泳圖譜中進樣口頂部條帶并未完全消失，說明形成的聚合物有部分未被還原，存在無法被β-巰基乙醇打斷的非二硫共價鍵，如酪氨酸殘基之間的共價交聯(lián)以及活性羰基-氨基等[32]。

2.9 丙二醛對白鰱肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖 9 丙二醛濃度對白鰱肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 9 Effect of MDA concentration on secondary structure content of myofibrillar protein from silver carp

由圖9可以看出，隨著丙二醛濃度的增加，白鰱肌原纖維蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量逐漸減少，無規(guī)卷曲相對含量略有下降，β-折疊相對含量逐漸增多。α-螺旋為位于多肽鏈內(nèi)部的緊密、不含空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性弱于α-螺旋[33]。 蛋白質(zhì)經(jīng)過氧化后，α-螺旋逐漸解旋，且部分轉(zhuǎn)化更為松散和舒展的β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，包埋于分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露出來，活性巰基含量和表面疏水性上升（圖3和圖5），肌球蛋白分子間的疏水相互作用增強，引起蛋白質(zhì)的聚合。

3 結(jié) 論

白鰱肌原纖維蛋白經(jīng)過丙二醛氧化修飾后羰基含量顯著上升，羰基和游離氨基含量在丙二醛濃度范圍0.05～0.50 mmol/L內(nèi)量效關(guān)系不明顯，變化不顯著，此濃度范圍內(nèi)酪氨酸單體未發(fā)生交聯(lián)聚合，表明肌原纖維蛋白未發(fā)生過度氧化。丙二醛濃度低于0.25 mmol/L時，總巰基和活性巰基含量變化不明顯，Ca2+-ATPase活性降低，表面疏水性升高；濃度達到0.25 mmol/L時，活性巰基含量還有Ca2+-ATPase活性顯著上升，蛋白溶解度隨著丙二醛濃度上升而下降。SDS-PAGE圖譜顯示，氧化使肌原纖維蛋白發(fā)生了交聯(lián)或聚合，產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于250 kDa的聚集體，聚集體的主要交聯(lián)方式為二硫鍵，但丙二醛濃度高于1 mmol/L時形成的聚集體中存在其他的交聯(lián)方式。隨著丙二醛濃度上升，蛋白α-螺旋相對含量減少，β-折疊相對含量增多，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸伸展，原本包埋的活性巰基暴露出來。以丙二醛為代表的脂肪氧化次級產(chǎn)物在適宜的濃度范圍內(nèi)引起的肌原纖維蛋白氧化程度較為溫和，能夠促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，暴露更多活性位點，有助于蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，可能對魚糜凝膠的形成有促進作用。