利用DHI奶樣檢測孕酮的可行性分析

鄒楊，婁文琦，劉林

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193）

孕酮，又名黃體酮、黃體素，是奶牛發(fā)情周期中由黃體產(chǎn)生的一種類固醇激素，在血液、乳汁和唾液中均能檢測到。孕酮的檢測對于牧場區(qū)分奶牛妊娠狀態(tài)、縮短產(chǎn)犢間隔、減少輸精次數(shù)有著非常重要的意義，能夠幫助牧場減少經(jīng)濟損失、節(jié)本增效。本文就孕酮的檢測方法及中紅外光譜檢測原理對利用DHI奶樣檢測孕酮進行了可行性分析，以期為牧場利用孕酮檢測數(shù)據(jù)指導生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 孕酮檢測的意義

隨著我國國民經(jīng)濟的發(fā)展、人們生活水平的提高和城市化進程的加快，肉、蛋、奶的消費量大幅度增加。與此同時，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)來說，養(yǎng)殖場對于養(yǎng)殖成本的要求更高，對精細化高效養(yǎng)殖技術的提升需求愈加迫切。

通過調查研究發(fā)現(xiàn)，奶牛產(chǎn)后能量負平衡、繁殖障礙和營養(yǎng)代謝病所帶來的牧場奶牛淘汰率高達30%。Fetrow等[1]對美國62.5萬頭淘汰奶牛的調研數(shù)據(jù)表明，產(chǎn)后20d內的淘汰率占總淘汰率的11%，產(chǎn)后20～40d的淘汰率占8%，明顯高于泌乳100d以后3%～4%的淘汰率。泌乳初期和泌乳高峰期的高淘汰率會給奶牛場帶來巨大的經(jīng)濟損失，而高淘汰率背后所隱藏的牧場繁殖問題主要是發(fā)情鑒定不準確、生殖系統(tǒng)功能異常和受孕率低[2]。

圖1 懷孕率對牧場效益的影響

威斯康辛大學麥迪遜分校比較了提高懷孕率對牧場效益的影響（圖1），圖中橫坐標是牧場當前懷孕率，縱坐標是牧場希望懷孕率能達到的指標。假設牧場當前懷孕率是15%，如果提高到期望的22%，每頭牛每年可以為牧場增加137美元的效益。

因此，快速有效地監(jiān)測奶牛發(fā)情狀態(tài)、減少空懷天數(shù)、提高受孕率，是改善牧場養(yǎng)殖效益水平的重要手段。同時，牛奶作為牧場最容易獲得的奶牛個體樣本，通過以奶樣為基礎，對反映奶牛產(chǎn)后繁殖系統(tǒng)恢復、早期妊檢、妊娠狀態(tài)的重要指標進行檢測與監(jiān)測，能夠提升牧場繁殖精準管理水平、間接為牛群繁殖性能改良提供數(shù)據(jù)支持。

2 孕酮與奶牛繁殖

奶牛在排卵后幾天（成熟卵子從卵泡排出進入子宮）就在卵巢上形成黃體，而孕酮是由黃體產(chǎn)生的，這種激素釋放到血液中，同時也擴散到牛奶中。奶牛在發(fā)情期由黃體分泌的孕酮水平是周期性變化的，在發(fā)情后2～3d內黃體開始增大，孕酮分泌增加，血液和奶中孕酮含量迅速升高直至發(fā)情周期的第10天，然后出現(xiàn)坪值，在下一個發(fā)情周期（大約在第21天）的第3～4天孕酮水平下降。一旦牛只妊娠，母牛在卵巢上形成的黃體將不斷產(chǎn)生孕酮。若沒有妊娠，則子宮產(chǎn)生前列腺素將黃體溶解，隨后孕酮的產(chǎn)生立即中止，新一輪的發(fā)情周期又將重新開始[2,3]。

圖2 母牛產(chǎn)后乳汁孕酮含量變化曲線圖[4]

圖3 正常奶牛產(chǎn)后乳中孕酮含量的變化[5]

從母牛產(chǎn)后孕酮含量變化曲線圖可以看出（圖2），奶牛產(chǎn)后15～20d孕酮含量出現(xiàn)第一低谷期，即產(chǎn)后首次安靜發(fā)情和排卵；產(chǎn)后30～35d為第一峰值期，即產(chǎn)后卵巢上新黃體發(fā)育期和子宮復舊基本完成期；產(chǎn)后40～45d為第二低谷期，即大多數(shù)母牛出現(xiàn)產(chǎn)后第一次發(fā)情期。所以牛在產(chǎn)后約1個月恢復卵巢周期性活動，約50d時第一次配種成功，配種后孕酮激素水平上升（圖3）。有研究表明，產(chǎn)后到首次黃體活動間隔的遺傳力為0.16[6]。

因此，通過個體孕酮水平的檢測可以用于確定排卵、孕激素治療監(jiān)測和早期妊娠狀態(tài)的評價；可以區(qū)分出已孕奶牛、休情期奶?；虬l(fā)情周期不規(guī)律的奶牛；可以反映產(chǎn)后奶牛的繁殖系統(tǒng)恢復情況；可以采集用作間接反映奶牛性狀的育種指標，用于群體改良。

3 孕酮的檢測方法

應用放射免疫技術檢測血液中孕酮濃度已開展多年，但是該方法費用昂貴，且需要特殊設備和訓練有素的人員，試驗期需3～7d。研究表明，奶中孕酮濃度是與血液中孕酮濃度相平行的[2]，證明牛奶中孕酮含量可以用來監(jiān)測牛只的繁殖狀態(tài)。

奶牛乳汁中孕酮常用檢測方法有放射免疫測定法（RIA）、酶聯(lián)免疫測定法、孕酮-ARIS 檢測系統(tǒng)以及免疫膠體金技術[3]。這幾種方法都是在免疫學基礎上進行的，且各有其優(yōu)缺點。

①放射免疫測定法具有靈敏度高、特異性強、應用范圍廣、操作方法簡便、測定準確率高的優(yōu)點，但是由于標記物具有放射性，且標記設備條件和技術要求較高，使其普及受到限制。

②酶聯(lián)免疫測定法具有易學、迅速、成本低、無污染、無需昂貴儀器設備和專門技術的優(yōu)點，但同時存在檢測試劑盒操作程序復雜、測試時間長、需要專門的儀器設備和操作人員等缺點。

③孕酮-ARIS檢測系統(tǒng)檢測全乳孕酮含量的準確性較放射免疫法較差，且奶樣中存在不利于ARIS測定的干擾因素。

④免疫膠體金技術是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。目前醫(yī)學檢驗中應用的免疫膠體金快速診斷技術有兩種，即膠體金快速免疫層析法和快速斑點免疫金滲濾法。

4 中紅外檢測

與傳統(tǒng)的化學分析方法相比，中紅外光譜分析方法對樣品處理的要求不高、無需化學試劑，且能夠快速無損地檢測樣品中各成分的含量。目前中紅外光譜分析不僅能準確測定牛奶中乳成分（包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率）、體細胞數(shù)，同時還能夠預測乳中脂肪酸、蛋白組分，以及牛奶的凝集性能[7]，并可用于酮病的檢測及相應性狀遺傳參數(shù)估計[8～11]，而且通過使用中紅外光譜技術對牛奶中特定物質建立預測模型，能夠快速準確地分析和鑒定奶牛的飼料轉化率、能量利用效率和甲烷排放等營養(yǎng)狀況、判定奶牛的健康和生殖生理狀況[12]。

5 中紅外法檢測牛奶中孕酮含量的可行性

中紅外光區(qū)是波長在2500～25000nm（波數(shù)為4000～400cm-1）的電磁波，是絕大多數(shù)有機物和無機離子的基頻吸收帶，也是紅外光譜中最適合進行紅外光譜定性和定量的分析區(qū)域[12]。

化合物不同的官能團在光譜上呈現(xiàn)不同譜帶數(shù)目、位置、性狀和強度，從而可以定性分析有機化合物的種類，同時也可以根據(jù)物質組分的吸收峰強度，結合朗伯-比耳定律對化合物進行定量分析[13～15]。

孕酮是4-孕甾烯-3,20-二酮（圖4），純固樣為白色或幾乎白色的結晶性粉末，屬于甾酮類化合物，分子含有兩個處于不同化學環(huán)境的極性基團C=O。

圖4 孕酮的化學結構式

圖5 孕酮的紅外光譜[16]

孕酮在1850～1500cm-1范圍有三個吸收峰，位置分別在1662（v1）、1698（v2）、1617（v3）cm-1，其中處于較低頻率的v1歸屬為C=O伸縮振動峰，處于較高頻率的v2應歸屬于C20位C=O伸縮振動峰，中等強度的v3為C=C鍵伸縮振動峰[16]。孕酮的三個吸收峰均在4000～400cm-1的中紅外光譜范圍內，因此用中紅外光譜法進行孕酮檢測具有理論可行性。

6 小結

孕酮的檢測對于牧場生產(chǎn)具有極大的作用，不僅可以檢測牛只妊娠狀態(tài)，還能夠幫助牧場進行繁殖監(jiān)控。而中紅外光譜法在牧場最廣泛的應用就是奶牛生產(chǎn)性能測定，檢測奶樣乳成分的同時在光譜分析中加入孕酮的檢測，可以最大限度地利用DHI奶樣，獲得最大化回報，幫助牧場提質增效。