lncRNA ZSWIM8-AS1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO增殖、凋亡、遷移和放射敏感性的影響

侯 歌，張家杰，肖陳虎，宋 銳，黃洋洋，袁金金，柴 婷，劉宗文

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科 鄭州 450014 2)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西安 710069

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。結(jié)直腸癌的治療手段主要有外科手術(shù)、放療和化療等，手術(shù)切除腫瘤前放療能夠延長部分患者生存時(shí)間，手術(shù)切除后放療可預(yù)防局部復(fù)發(fā)[2]。但由于部分患者出現(xiàn)放療抵抗等現(xiàn)象，常導(dǎo)致放療效果不佳[3]，因此，提高腫瘤細(xì)胞的放療敏感性一直是研究者們關(guān)注的重點(diǎn)問題。

ZSWIM8-AS1是ZSWIM8基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄本，屬于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。有研究[4]報(bào)道，ZSWIM8-AS1在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，其低表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期等病理特征密切相關(guān)，且其低表達(dá)的患者預(yù)后不良。LncBase Predicted v.2生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，ZSWIM8-AS1可能與miR-15b靶向結(jié)合。有研究[5]顯示，miR-15b在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)的患者預(yù)后不良，下調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的集落形成、侵襲和遷移能力。本研究以結(jié)直腸癌RKO細(xì)胞為研究對(duì)象，探討ZSWIM8-AS1對(duì)RKO細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及放射敏感性的影響，并以miR-15b為切入點(diǎn)，探討ZSWIM8-AS1影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的靶向分子治療提供新靶標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象結(jié)直腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織(離癌組織>3 cm，且未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)標(biāo)本源自2017年10月至2019年1月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院首診并經(jīng)病理學(xué)確診的25例患者，其中男17例，女8例，年齡46～72歲；高分化5例，中分化9例，低分化11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，未轉(zhuǎn)移10例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者。②合并心、腎、肝等重要臟器功能障礙者。③合并自身免疫系統(tǒng)疾病者。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑結(jié)直腸癌RKO細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒和胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR引物、ZSWIM8-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-ZSWIM8-AS1)、空載體(pcDNA)、miR-15b抑制劑(anti-miR-15b)、抑制劑對(duì)照序列(anti-miR-NC)、miR-15b模擬物(miR-15b mimics)和模擬陰性序列(miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司，兔抗人Ki-67、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和GAPDH抗體購自Abcam公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 組織標(biāo)本中ZSWIM8-AS1和miR-15b表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè)采用Trizol試劑提取組織標(biāo)本中的總RNA，使用微量核酸儀對(duì)總RNA純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行q-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。ZSWIM8-AS1正向引物序列：5’-CCGGATCGCATTCACAAAGT-3’，反向引物序列：5’-TGTTTCTCCCAACTGGCTCT- 3’；miR-15b正向引物序列：5’-ATGGCCGATGATAGATGTAC-3’，反向引物序列：5’-CTGGAAGTGCTACACGTGC-3’；GAPDH正向引物序列：5’-GCCATCACAGCAACA CAGAA-3’，反向引物序列：5’-GCCATACCAGTA AGCTTGCC-3’；U6正向引物序列：5’-GTCCGAGAT GTCGAAC-3’，反向引物序列：5’-GTGCCAATGTA AGCTGATAAC-3’。ZSWIM8-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-15b以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算ZSWIM8-AS1和miR-15b相對(duì)表達(dá)量。

1.4 ZSWIM8-AS1與miR-15b靶向調(diào)控關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PCR擴(kuò)增含miR-15b結(jié)合位點(diǎn)的ZSWIM8-AS1的3’UTR序列，同時(shí)利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)使結(jié)合位點(diǎn)突變，插入pmir GLO熒光素酶載體，分別構(gòu)建ZSWIM8-AS1野生型熒光素酶載體(ZSWIM8-AS1-WT)和突變型熒光素酶載體(ZSWIM8-AS1-MUT)。RKO細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別將ZSWIM8-AS1-WT、ZSWIM8-AS1-MUT與miR-15b mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至RKO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞。參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說明，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組將RKO細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5 %CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取傳代培養(yǎng)的RKO細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)。待細(xì)胞融合至60%時(shí)，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，將ZSWIM8-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-ZSWIM8-AS1組)、空載體(pcDNA組)、miR-15b抑制劑(anti-miR-15b組)、抑制劑對(duì)照序列(anti-miR-NC組)、ZSWIM8-AS1過表達(dá)載體與miR-15b mimics(pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組)、ZSWIM8-AS1過表達(dá)載體與模擬陰性序列(pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組)分別轉(zhuǎn)染至RKO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 各組細(xì)胞存活率的CCK-8法檢測(cè)1.5項(xiàng)中各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1.0×104個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，加10 μL CCK-8，孵育1.5 h后，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 各組細(xì)胞凋亡的檢測(cè)1.5項(xiàng)中各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2.5×104個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，加500 μL結(jié)合緩沖液重懸，加10 μL Annexin V-FITC，輕輕混合均勻后，避光孵育10 min。再加5 μL PI，輕輕混合均勻后，避光反應(yīng)5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 各組細(xì)胞遷移情況的Transwell小室檢測(cè)1.5項(xiàng)中各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。Transwell小室置于24孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，上室加100 μL細(xì)胞懸液，下室加500 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，4 g/L結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡觀察。選取5個(gè)視野(×200)，拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 各組細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)1.5項(xiàng)中各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔200個(gè)，采用美國 Varian 600直線加速器分別以0、2、4、6、8 Gy 6 MV X射線照射，源靶距100 cm，劑量率3.2 Gy/min。照射后，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)數(shù)克隆(>50個(gè)細(xì)胞的集落)，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率(plating efficiency，PE)，PE=(實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù))×100%。計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF)，SF=實(shí)驗(yàn)組PE/對(duì)照組PE。使用GraphPad Prism 5.0軟件，單擊多靶數(shù)學(xué)模型擬合細(xì)胞存活曲線，按照公式“SF=1-(1-e-D/D0)N”計(jì)算D0。D為照射劑量，N為外推數(shù)，Dq為準(zhǔn)域劑量，D0為平均致死劑量。計(jì)算放射增敏比(SER)。SER=對(duì)照組D0/實(shí)驗(yàn)組D0。

1.10 各組細(xì)胞中Ki-67、Cleaved Caspase-3、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)1.5項(xiàng)中各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2.5×104個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化。RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白含量。取適量蛋白溶液，加1×上樣緩沖液混合均勻，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE，將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液封閉2 h。分別加入Ki-67(按1∶1 000稀釋)、Cleaved Caspase-3(按1∶500稀釋)、N-cadherin(按1∶1 000稀釋)、E-cadherin(按1∶1 000稀釋)和GAPDH(按照1∶1 000稀釋)一抗，4 ℃孵育12 h。TBST洗膜3次，5 min/次。加入山羊抗兔二抗(按照1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)比較結(jié)直腸癌和癌旁組織中ZSWIM8-AS1和miR-15b表達(dá)的差異，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較不同處理組和相應(yīng)對(duì)照組RKO細(xì)胞中ZSWIM8-AS1和miR-15b表達(dá)、細(xì)胞存活率、凋亡率遷移細(xì)胞數(shù)以及Ki-67、Cleaved Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中ZSWIM8-AS1和miR-15b的表達(dá)見表1。與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織中ZSWIM8-AS1表達(dá)降低(P<0.05)，miR-15b表達(dá)升高(P<0.05)。

表1 結(jié)直腸癌和癌旁組組織中ZSWIM8-AS1和miR-15b的表達(dá)

2.2 ZSWIM8-AS1與miR-15b靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預(yù)測(cè)顯示的ZSWIM8-AS1與miR-15b的結(jié)合位點(diǎn)見圖1。驗(yàn)證結(jié)果見表2：與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ZSWIM8-AS1和miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ZSWIM8-AS1和miR-15b組細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；而與共轉(zhuǎn)染MUT-ZSWIM8-AS1和miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染MUT-ZSWIM8-AS1和miR-15b組細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)；表明ZSWIM8-AS1可與miR-15b靶向結(jié)合。

圖1 ZSWIM8-AS1與miR-15b核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)

表2 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果(n=9)

2.3 各組RKO細(xì)胞中ZSWIM8-AS1和miR-15b表達(dá)水平的比較見表3。與pcDNA組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1組pcDNA-ZSWIM8-AS1組細(xì)胞中ZSWIM8-AS1表達(dá)升高(P<0.05)，miR-15b表達(dá)降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-15b組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)降低(P<0.05)。與pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)升高(P<0.05)。

表3 各組RKO細(xì)胞中ZSWIM8-AS1和miR-15b表達(dá)的比較(n=9)

2.4 各組RKO細(xì)胞存活率、凋亡率和遷移細(xì)胞數(shù)的比較見圖2、表4。與pcDNA組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1組細(xì)胞存活率和遷移數(shù)降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-15b組細(xì)胞存活率和遷移數(shù)降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。與pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組細(xì)胞存活率和遷移數(shù)升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。

A：pcDNA組；B：pcDNA-ZSWIM8-AS1組；C：anti-miR-NC組；D：anti-miR-15b組；E：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組；F：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組

表4 各組RKO細(xì)胞存活率、凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)的比較( n=9)

2.5 各組RKO細(xì)胞放射敏感性結(jié)果與pcDNA組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1組細(xì)胞SF降低(P<0.05)，增敏比為1.747。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-15b組細(xì)胞SF降低(P<0.05)，增敏比為1.977。與pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組細(xì)胞SF升高(P<0.05)，增敏比為0.645。詳見表5。

表5 各組RKO細(xì)胞放射生物學(xué)相關(guān)參數(shù)

2.6 各組RKO細(xì)胞中Ki-67、Cleaved Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)比較見圖3、表6。與pcDNA組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1組細(xì)胞中Ki-67和N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-15b組細(xì)胞中Ki-67和N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組細(xì)胞中Ki-67和N-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

1：pcDNA組；2：pcDNA-ZSWIM8-AS1組；3：anti-miR-NC組；4：anti-miR-15b組；5：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC組；6：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b組

表6 各組RKO細(xì)胞中Ki-67、Cleaved Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平比較(n=9)

3 討論

lncRNA可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳等多個(gè)方面參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生命過程，可作為腫瘤等多種疾病治療的分子靶點(diǎn)。研究已表明，HOTAIR[6]、TINCR[7]和DSCAM-AS1[8]等多個(gè)lncRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高，作為促癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展；而TUBA4B[9]和B3GALT5-AS1[10]等lncRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，其過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。ZSWIM8-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在結(jié)直腸癌中的作用尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中ZSWIM8-AS1的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，與相關(guān)報(bào)道[4]結(jié)果一致，提示ZSWIM8-AS1可能作為抑癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展；通過過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞中ZSWIM8-AS1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ZSWIM8-AS1可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示ZSWIM8-AS1有可能成為結(jié)直腸癌治療的分子靶點(diǎn)。放療抵抗是結(jié)直腸癌放療失敗的主要原因，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性可提高放療療效，改善患者預(yù)后[11]。本研究結(jié)果還顯示，過表達(dá)ZSWIM8-AS1的結(jié)直腸癌細(xì)胞經(jīng)放射線照射后，存活分?jǐn)?shù)降低，增敏比為1.747，表明過表達(dá)ZSWIM8-AS1可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性。

細(xì)胞增殖紊亂和凋亡受阻是腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制之一，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的重要策略[12]。Ki-67是在細(xì)胞增殖中表達(dá)的一種核抗原，其表達(dá)水平升高時(shí)細(xì)胞的增殖活性也隨之升高[13]。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其被活化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)ZSWIM8-AS1抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)，而促進(jìn)了Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，提示過表達(dá)ZSWIM8-AS1可能通過調(diào)控細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)及Caspase-3的活化來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。EMT發(fā)生時(shí)，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)升高。本研究顯示，過表達(dá)ZSWIM8-AS1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中N-cadherin蛋白表達(dá)，而促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，提示過表達(dá)ZSWIM8-AS1可能通過抑制EMT過程來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移。

為了進(jìn)一步探究ZSWIM8-AS1影響結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型及放射敏感性的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了ZSWIM8-AS1可與miR-15b靶向結(jié)合，其過表達(dá)ZSWIM8-AS1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-15b的表達(dá)。miR-15b在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，miR-15b在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌[16]、肺腺癌[17]和乳腺癌[18]組織中表達(dá)升高，降低其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及EMT過程；而miR-15b在胃癌[19]、卵巢癌[20]、肝細(xì)胞癌[21]和膠質(zhì)瘤[22]等腫瘤組織中表達(dá)降低，發(fā)揮抑癌基因作用。這說明miR-15b在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同。本研究顯示，miR-15b在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放射線敏感性，增敏比為1.977，說明miR-15b作為促癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究還顯示，過表達(dá)miR-15b逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)ZSWIM8-AS1對(duì)RKO細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及放射敏感性的影響，提示過表達(dá)ZSWIM8-AS1可能通過負(fù)調(diào)控miR-15b來抑制RKO增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，ZSWIM8-AS1在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，而miR-15b呈高表達(dá)，過表達(dá)ZSWIM8-AS1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及對(duì)放射線的敏感性，其作用機(jī)制與靶向負(fù)調(diào)控miR-15b有關(guān)，ZSWIM8-AS1/miR-15b軸可能為結(jié)直腸癌的治療提供了新靶標(biāo)。