美洲南瓜種皮發(fā)育相關(guān)物質(zhì)含量變化研究

李文亮 王有德 陳揚(yáng) 馬仁輝 王夢(mèng)霞 李發(fā)康 徐秉良 薛應(yīng)鈺

摘要：以美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28為試材，研究了種皮發(fā)育過(guò)程中種皮鮮重、種皮干重、可溶性糖、淀粉、纖維素、半纖維素和酚類物質(zhì)的變化規(guī)律，結(jié)果表明：種皮鮮重，從授粉至種子成熟有殼美洲南瓜高于無(wú)殼美洲南瓜，且均逐漸增加;種皮干重，有殼美洲南瓜隨種子成熟逐漸增加，無(wú)殼美洲南瓜種皮干重隨種子成熟逐漸減少，但從授粉開(kāi)始至授粉20 d有殼美洲南瓜的種皮干重低于無(wú)殼美洲南瓜;可溶性糖，有殼美洲南瓜呈低-高-低趨勢(shì)，無(wú)殼美洲南瓜呈逐漸降低趨勢(shì)，且總體上有殼美洲南瓜高于無(wú)殼美洲南瓜;淀粉含量波動(dòng)較大，總體基本呈降低趨勢(shì)，而且無(wú)殼美洲南瓜低于有殼美洲南瓜;纖維素含量無(wú)殼美洲南瓜低于有殼美洲南瓜，從授粉開(kāi)始至授粉20 d均呈降低趨勢(shì)，但授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜逐漸增加，而無(wú)殼美洲南瓜則逐漸降低;半纖維素和酚類物質(zhì)的變化趨勢(shì)相似，即有殼美洲南瓜高于無(wú)殼美洲南瓜，而且從授粉開(kāi)始至授粉20 d均呈增加趨勢(shì)，授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜持續(xù)增加，而無(wú)殼美洲南瓜則逐漸降低，接近于0。

關(guān)鍵詞：美洲南瓜;種皮發(fā)育;相關(guān)物質(zhì);含量

中圖分類號(hào)：S642.6? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2020）02-0015-06

Abstract：To study the influence of NaCl stress on the growth and ions transport of flax seedlings， the absorption， distribution and accumulation of saline ions in seedlings of flax were analysed by water culture experiment. The results showed that the fresh and dry weight， the water and chlorophyll content of flax seedlings all increased slightly under NaCl（≤100 mmol/L） stress， and decreased with increasing concentration of NaCl. Whether above-ground or under-ground tissue of flax seedlings， the membrane permeability increased， but the contents of free proline and soluble protein all increased firstly and then decreased slowly with increasing NaCl concentration. The content of Na+ and Cl- in the roots， stems and leaves of flax seedlings all showed increasing trend with increasing NaCl concentration， the accumulation of Na+ and Cl- were in ascending order： stem， root， leaf， and leaf， stem， root， respectively. The loss of Ca2+ and K+ were in ascending order： leaf， stem， root， and stem， root， leaf， respectively. More Na+ were accumulated in leaves of flax seedlings under higher salt stress， which resulted in the more loss of K+ from leaves;the loss of Ca2+ started from roots， which could delay the loss from stem and leaves and then alleviate the salt damage.

Key words：Flax;NaCl stress;Seedlings growth;Ion absorption and transport

裸仁南瓜（Cucurbita pepo L.）是自然界一種罕見(jiàn)的南瓜突變類型，最早在19世紀(jì)后期發(fā)現(xiàn)[1 - 2 ]。因其瓜子無(wú)殼，食用方便，種子含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及硒、鈣、鋅、鎂、磷、鐵、鈉等8種主要的微量元素，維生素C、維生素F、維生素B1、維生素B2、維生素H等多種維生素和8種人體必需的氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富而享譽(yù)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，成為我國(guó)的一種稀有產(chǎn)品[3 ]。

植物種皮來(lái)源于胚珠的珠被。據(jù)植物科研生產(chǎn)和我們的前期研究，美洲南瓜種皮主要由5層構(gòu)成，即由外到里依次為表皮層、下皮層、厚壁組織層、軟組織層和綠色組織層[4 ]。關(guān)于植物種皮合成過(guò)程中物質(zhì)的變化主要集中在對(duì)種皮色素形成相關(guān)物質(zhì)的研究，李曉敏等[5 ]對(duì)種子種皮色素進(jìn)行了分離及種類鑒定，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型黑籽油菜和黃籽油菜種皮中均含有花色素、大量黃酮醇、少量的異黃酮昔及黃酮醇昔。擬南芥種皮的成色物質(zhì)主要為類黃酮類化合物，其中黃酮醇和原花色素積累于種皮中，是種皮色素的主要類 型[6 ]。但是對(duì)于種皮發(fā)育過(guò)程中種皮形成甚至種皮缺失與相關(guān)物質(zhì)含量的變化研究甚少。

我們以武威金蘋果有限責(zé)任公司育成的美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28為試材，研究其種皮發(fā)育過(guò)程中， 種皮鮮重、干重、可溶性糖、淀粉、纖維素、半纖維素和酚類物質(zhì)的變化規(guī)律，尋找 2 個(gè)品種種皮產(chǎn)生差異的某些原因，以期為調(diào)控種皮發(fā)育和進(jìn)行裸仁南瓜的選育提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

2008年4月30日在武威金蘋果有限責(zé)任公司試驗(yàn)基地播種美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28，于7月上旬即開(kāi)花盛期進(jìn)行嚴(yán)格自交授粉，每個(gè)品種至少授粉10株，并掛牌標(biāo)記，分別于授粉后10、15、20、25、30、35、40、45、50 d，采集種皮1 g，每個(gè)組織共20 g，用錫箔紙包好置于液氮管中帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰柜中。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?種皮鮮重和干重測(cè)定? ?采用烘干稱重法[7 ]。從授粉至種子成熟共采集種皮10次，每次采集有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28的種子各10粒，帶回室內(nèi)洗凈晾干，稱量鮮重;將種皮風(fēng)干后于80 ℃溫度下烘干至恒重測(cè)定其干重。

1.2.2? ?可溶性總糖含量和淀粉含量測(cè)定? ?采用蒽酮比色法測(cè)種皮可溶性糖及淀粉的含量，繪制葡萄糖含量與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[8 ]。測(cè)出溶液光密度值后，依標(biāo)準(zhǔn)曲線求出葡萄糖含量，再由以下公式分別計(jì)算出可溶性糖含量及淀粉含量。

式中W1為可溶性糖含量，W2為淀粉含量;c（μg/管）為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得葡萄糖含量;a（mL）為顯色時(shí)所取樣品量;b（mL）為除色素時(shí)吸取提取液的量;V1（mL）為樣品中可溶性糖提取液的量;m（g）為樣品干重;10（mL）為除色素時(shí)可溶性糖的溶解體積;V2（mL）為樣品中淀粉水解液總體積;0.9為葡萄糖換算為淀粉的系數(shù)。

1.2.3? ?纖維素含量測(cè)定? ?采用72%濃硫酸水解法測(cè)定種皮纖維素含量[9 ]。稱取0.5～1.0 g種皮置于試管中，加入5 mL醋酸和硝酸混合液，蓋上球形玻蓋，置沸水浴中加熱25 min，并不斷攪拌;取出、冷卻后離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水沖洗3次;向沉淀中加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硫酸和10 mL 0.1 mol/L的重鉻酸鉀溶液，搖勻，浸入沸水浴中10 min，取出后倒入三角瓶中，用適量蒸餾水沖洗試管3次，一并倒入三角瓶中;溶液冷卻后加5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% KI溶液和1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的淀粉溶液，用0.2 mol/L硫代硫酸鈉滴定（碘量法），另外單獨(dú)滴定加入了10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸的0.1 mol/L的重鉻酸鉀溶液10 mL作為空白樣。纖維素含量按公式：X=K（a-b）/（n×24）計(jì)算，式中X 為纖維素含量，“24”為1 mol C6H10O5相當(dāng)于硫代硫酸鈉的當(dāng)量數(shù);K為硫代硫酸鈉濃度（mol/L）;a為空白滴定所耗硫代硫酸鈉體積（mL）;b為溶液所耗硫代硫酸鈉體積（mL）;n為種皮質(zhì)量（g）。

1.2.4? ?半纖維素含量測(cè)定? ?采用銅碘法。稱取自然風(fēng)干的種皮粉末0.5～1.0 g，數(shù)值為n;裝入小燒杯中，加入15 mL 80%的硝酸鈣溶液，蓋好加熱至沸騰，在慢慢沸騰的情況下加熱5 min分步離心，分別用10 mL熱水洗滌沉淀3次，在沉淀中加入10 mL? ?2 mol/L的鹽酸，攪勻，沸水浴中攪拌情況下微沸45 min，離心，殘?jiān)謩e用10 mL蒸餾水沖洗3次，沖洗后的水溶液合并在離心液中，加入1滴酚酞，用2 mol/L氫氧化鈉溶液中和到顯橙紅色，轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶，稀釋到刻度，用干燥濾紙過(guò)濾到干燥燒杯中，移液管吸取10 mL濾液，加入10 mL堿性銅試劑，蓋好在沸水中煮15 min，冷卻，加入5 mL草酸-硫酸混合液，加入0.5 mL 0.5%淀粉，用0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失，用去b mL;取10 mL堿性銅試劑，加5 mL草酸-硫酸混合液，再加10 mL濾液，加入0.5 mL 0.5%的淀粉，0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失，用去a mL。種皮中半纖維素的含量計(jì)算公式：x%=0.9×100[248-（a-b）]（a-b）/10 000×10×n，式中x為半纖維素含量，0.9為還原糖與半纖維素?fù)Q算系數(shù)。

1.2.5? ?酚類物質(zhì)含量測(cè)定? ?參照Rodrigues? ?等[10 ]的方法。取1.0 g冷凍種皮到Ependorf管中，加入1.5 mL的80%甲醇，用鋁箔包裹Ependorf管，防止光氧化，在25 ℃下，用150 r/min振蕩過(guò)夜。提取物在12 000轉(zhuǎn)/g離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的Ependorf管中，在-20 ℃下保存。取上清液（甲醇提取物）150 μL，加入0.25 mol/L的Folin-酚試劑150 μL，搖勻，室溫下保持5 min。接著加入150 μL的1 mol/L Na2CO3溶液，搖勻，在室溫下保持10 min。向混合物加入1 mL雙蒸水，搖勻。室溫下保持1 h?；旌衔镌?25 nm下比色，測(cè)定吸光度。用鄰苯二酚做標(biāo)準(zhǔn)，單位為mg/g。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?種皮鮮重和干重

種皮鮮重測(cè)定結(jié)果表明，有殼品種04L Ag-26-2隨著種子的成熟，種皮增厚，鮮重增加;而無(wú)殼品種04LAg-26-28的種皮隨種子成熟，種皮鮮重呈下降趨勢(shì)。干重測(cè)定結(jié)果表明，在授粉20 d前，無(wú)殼品種04L Ag-26-28的干重高于有殼品種04LAg-26- 2;20 d后，有殼品種04LAg-26-2種皮干重逐漸升高，而無(wú)殼品種04LAg-26-28呈降低趨勢(shì)（圖1、圖2）。

2.2? ?可溶性總糖含量

參照葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），從圖4可以看出，有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28中可溶性糖含量存在明顯差異，在種子發(fā)育過(guò)程中，無(wú)殼品種04LAg-26-28中可溶性糖含量明顯低于有殼品種04LAg-26-2，而且變化幅度較小，比較平穩(wěn)。有殼品種04LAg-26-2中可溶性糖含量變化幅度較大。

2.3? ?淀粉含量

參照淀粉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），從圖6可以看出，有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28中淀粉含量差異較大。無(wú)殼品種04LAg-26-28中淀粉含量總體低于有殼品種，變化幅度較大，呈現(xiàn)高—低—高—低趨勢(shì)，而有殼品種04LAg-26-2中淀粉含量隨種子的成熟呈降低趨勢(shì)。

2.4? ?半纖維素含量

從圖7可以看出，美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28種皮中半纖維素含量存在明顯差異。有殼品種04LAg-26-2授粉后，隨著種子的成熟，半纖維素逐漸增加，直至50 d種子成熟時(shí)，含量達(dá)到最大值（3.024%）。而無(wú)殼品種04LAg- 26-28種皮中半纖維素含量總體呈先增加后降低的趨勢(shì)，即授粉后20 d前，其含量和有殼品種04LAg-26-2含量接近，20 d后，隨著種子的成熟，半纖維素含量逐漸降低，直至種子成熟時(shí)，含量?jī)H為0.157%。

2.5? ?纖維素含量

纖維素含量測(cè)定結(jié)果（圖8）表明，美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2種皮纖維素含量均高于無(wú)殼品種04LAg-26-28，隨著種子的成熟呈高 — 低 — 高變化趨勢(shì)，即從授粉開(kāi)始至授粉20 d纖維素含量逐漸降低，授粉20 d后，隨著種子的成熟，纖維素含量逐漸增加;而無(wú)殼品種04LAg-26-28總體上基本呈降低趨勢(shì)，即從授粉開(kāi)始至授粉20 d，變化趨勢(shì)與有殼品種04LAg-26-2相同，但含量低于有殼品種04LAg-26-2，授粉20 d后至種子成熟，纖維素含量持續(xù)下降，種子成熟時(shí)（授粉后50 d）含量為0.03%。

2.6? ?酚類物質(zhì)含量

如圖9所示，美洲南瓜有殼品種04LAg- 26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28種皮中酚類物質(zhì)含量變化差異較大，其總體變化趨勢(shì)和半纖維素相似。即有殼品種04LAg-26-2授粉后，隨著種子的成熟，酚類物質(zhì)含量逐漸增加，直至50 d種子成熟時(shí)，含量達(dá)到最大值。而無(wú)殼品種04LAg-26-28種皮中酚類物質(zhì)含量總體呈先增加后降低的趨勢(shì)，即授粉后20 d前，其含量和有殼品種04LAg- 26-2含量接近，20 d后，隨著種子的成熟，酚類物質(zhì)含量逐漸降低，直至種子成熟時(shí)，含量?jī)H為0.313 9 mg/g。

3? ?結(jié)論與討論

從授粉至種子成熟，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2種皮鮮重高于無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28，且逐漸增加，而對(duì)于種皮干重來(lái)說(shuō)，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2的種皮干重隨種子成熟逐漸增加，無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28種皮干重隨種子成熟逐漸減少，但是，從授粉開(kāi)始至授粉20d有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2的種皮干重低于無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28。有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2種皮中可溶性糖呈低—高—低趨勢(shì)，無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28可溶性糖呈逐漸降低趨勢(shì)，且總體上有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2高于無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28;淀粉含量波動(dòng)較大，總體基本呈降低趨勢(shì)，而且無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28低于有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2;纖維素含量無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28低于有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2，從授粉開(kāi)始至授粉20 d均呈降低趨勢(shì)，但授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2逐漸增加，而無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28則逐漸降低;半纖維素和酚類物質(zhì)的變化趨勢(shì)相似，即有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2高于無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28，而且從授粉開(kāi)始至授粉20 d均呈增加趨勢(shì)，授粉20 d至種子成熟，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2持續(xù)增加，而無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28則逐漸降低，接近于0。

可溶性糖含量的高低，反映了植株體內(nèi)可利用態(tài)物質(zhì)和能量的供應(yīng)基礎(chǔ)[11 ]。糖的大量積累對(duì)初生壁的形成和木質(zhì)素的沉積及纖維素和半纖維素的形成是至關(guān)重要的[12 ]。試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲南瓜無(wú)殼品種04LAg-26-28中可溶性糖含量低于有殼品種中可溶性糖含量，而且美洲南瓜有殼品種04LAg-26-2和無(wú)殼品種04LAg-26-28在授粉后20 d可溶性糖含量達(dá)到最高值，此后持續(xù)下降，至種子成熟時(shí)，含量接近于0，這說(shuō)明糖的積累階段，為種皮的正常分裂分化和后期木素沉積提供前體物質(zhì)基礎(chǔ)。

纖維素、半纖維素是次生木質(zhì)部細(xì)胞壁的主要成分。纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分，單位體積纖維素含量的多少直接關(guān)系到機(jī)械組織是否發(fā)達(dá)[13 ]。我們通過(guò)對(duì)無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-2和有殼美洲南瓜品種04LAg-26-28中纖維素含量比較發(fā)現(xiàn)，有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2隨種子的成熟，種皮加厚，種皮中纖維素含量持續(xù)增加，而無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28隨種子的成熟，種皮退化，纖維素含量顯著降低。

酚類物質(zhì)是合成木質(zhì)素的前體，其含量和種類對(duì)木質(zhì)素合成有重要影響，酚類物質(zhì)自身的氧化交聯(lián)和形成的二聚體也可使細(xì)胞壁增厚，促進(jìn)植物組織木質(zhì)化[14 ]。初生細(xì)胞壁酚類物質(zhì)的累積，促使細(xì)胞壁硬化，高等植物細(xì)胞次生壁中酚類物質(zhì)的大量積累提高了細(xì)胞壁硬度，阻止了細(xì)胞壁延伸，由此可見(jiàn)酚類物質(zhì)的積累可能在植物細(xì)胞壁的停止伸長(zhǎng)后在細(xì)胞壁硬化中起著一定的作用[11 ]。我們的試驗(yàn)證明，隨著種子的成熟，有殼美洲南瓜種皮品種04LAg-26-2中的酚類物質(zhì)含量持續(xù)增加，無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28種皮中的酚類物質(zhì)含量逐漸減少，而且有殼美洲南瓜品種04LAg-26-2種皮中的酚類物質(zhì)高于無(wú)殼美洲南瓜品種04LAg-26-28種皮中的酚類物質(zhì)，這與萬(wàn)政敏等[15 ]對(duì)核桃仁種皮中的多酚類物質(zhì)的研究結(jié)果相一致。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）