珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)安絲菌素P-3的分離純化工藝優(yōu)化

吳興可，祁荃，卞婷婷，劉蘇煜，谷藝明，郭靜，蔡志強(qiáng)

（常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇常州213164）

安絲菌素（ansamitocin）主要是通過(guò)珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的苯安莎類抗生素[1]，具有良好的抗腫瘤活性[2]。它是一種19元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，根據(jù)其C-3 位側(cè)鏈R 基的不同，可分為AP-1、AP-3、AP-2、AP-3’和AP-4 這五個(gè)部分，其中AP-3是主要成分之一且其抗腫瘤細(xì)胞毒性最強(qiáng)[3]，可用于抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）的研發(fā)[4]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。據(jù)報(bào)道，安絲菌素微生物發(fā)酵水平較低，純化工藝復(fù)雜，分離提取成本高，因此提高回收率，簡(jiǎn)化純化工藝，是目前迫切需要解決的問(wèn)題[5-6]。

圖1 安絲菌素結(jié)構(gòu)式

近幾年，學(xué)者主要通過(guò)誘變菌株、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基或改造基因、代謝節(jié)點(diǎn)等[7-9]來(lái)提高AP-3的發(fā)酵產(chǎn)量。在分離純化上，傳統(tǒng)方法有柱色譜法，但是該法有很多局限性，工藝繁瑣，得率低；到20世紀(jì)80 年代發(fā)展起來(lái)的高效逆流色譜法與傳統(tǒng)方法不同，是無(wú)需固體填料的高效分離技術(shù)，該法獲得安絲菌素P-3 純度達(dá)98%以上，回收率為80%，然而成本較高[10]；美國(guó)一份專利[11]通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行熱滅活處理后再進(jìn)行分離純化，另一份免疫基因公司申請(qǐng)專利[12]通過(guò)添加氯仿來(lái)使微生物滅活，再用硅膠柱和氧化鋁柱吸附層析，發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理后會(huì)顯著降低后期分離純化難度，由于專利保護(hù)或用于商業(yè)用途該結(jié)果沒(méi)有對(duì)外公開。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)的安絲菌素發(fā)酵液組成成分繁多且復(fù)雜，除了發(fā)酵產(chǎn)品AP-3 之外，還包括所培養(yǎng)的微生物菌體（菌絲、菌球）及未利用的培養(yǎng)基成分、發(fā)酵過(guò)程中的副產(chǎn)物等，主要是色素及易溶于有機(jī)溶劑中的酶等。這些雜質(zhì)的存在會(huì)給安絲菌素的分離純化帶來(lái)困難，影響目標(biāo)物質(zhì)的回收率和質(zhì)量，所以在分離提取前，必須對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理。

本文通過(guò)對(duì)安絲菌素發(fā)酵液進(jìn)行菌體分離、酸處理、活性炭吸附及解吸附等一系列預(yù)處理，有效地去除了發(fā)酵液中的菌體、雜蛋白質(zhì)及色素，然后利用中性氧化鋁對(duì)處理過(guò)的收集液進(jìn)行分離純化，建立了快速分離純化安絲菌素P-3的方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

珍貴橙色束絲放線菌變種（Actinosynnema pretiosumssp.auranticumB126-29） 為 本 實(shí) 驗(yàn) 室DES化學(xué)誘變所得的安絲菌素生產(chǎn)菌株。

種子培養(yǎng)基：甘油10g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉3g/L，pH=7.4，115℃滅菌30min。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油20g/L，蔗糖25g/L，玉米漿10g/L，前體異丁醇2g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，七水合硫酸亞鐵0.01g/L，pH 7.4，115℃滅菌30min。

1.2 材料與儀器

發(fā)酵液：實(shí)驗(yàn)室保藏的珍貴橙色束絲放線菌變種（Actinosynnema pretiosumssp.auranticumstrain B126-29）二次活化后接種于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，220r/min 發(fā) 酵7 天 所 得；AP-3 標(biāo) 準(zhǔn) 品（HPLC 級(jí)，購(gòu)于藥明康德天津分公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀；R1001-VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，PB-10 酸度計(jì)；S53 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；硅藻土過(guò)濾裝置實(shí)驗(yàn)室自制；牛血清蛋白質(zhì)、考馬斯亮藍(lán)、活性炭、硅藻土購(gòu)于上海生工。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 液相色譜條件

UV 檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；色譜柱為EclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm×5μm），柱 溫25℃；流動(dòng)相為甲醇-水（體積比70∶30），流速0.8mL/min；進(jìn)樣量20μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取適量AP-3 標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中，將其配制成800mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液作為母液，按梯度稀釋成0、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L 濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，在1.4.1節(jié)的色譜條件下平行測(cè)定3 次，平均峰面積為橫坐標(biāo)，AP-3標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

AP-3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.031x-4.62（R2=0.9999）線性擬合良好，可用于發(fā)酵液中AP-3含量的計(jì)算。

圖2 AP-3的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 AP-3濃度測(cè)定

從搖瓶中吸取5mL 發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯充分混合震蕩后8000r/min 離心5min，吸取上層乙酸乙酯層，如此反復(fù)萃取三次后，在45℃下進(jìn)行旋蒸，蒸干后溶于1mL甲醇（HPLC 級(jí)）充分溶解后過(guò)0.22μm的微孔濾膜，根據(jù)1.4.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中AP-3的含量[13]。

1.3.4 除菌量的測(cè)定

取適量發(fā)酵液，稀釋，測(cè)量發(fā)酵液在波長(zhǎng)660 nm 處的光密度值，控制在0.3～0.8 范圍內(nèi)；測(cè)量值乘以稀釋倍數(shù)，即為發(fā)酵液中菌體生物量，從而確定菌體的去除率。

1.3.5 雜蛋白質(zhì)測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]。

1.3.6 計(jì)算公式

安絲菌素P-3 的除菌率，生產(chǎn)過(guò)程安絲菌素P-3的回收率、除雜蛋白質(zhì)率、脫色率、吸附率的計(jì)算如式(1)～式(5)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

（1）硅藻土添加量的影響 將濾紙浸濕后，鋪于抽濾漏斗的底部，將硅藻土與水的均勻混液倒入鋪好濾紙的漏斗內(nèi)，待硅藻土沉淀后，開啟真空泵進(jìn)行真空抽濾，抽濾壓力為0.1MPa。硅藻土形成1～2cm 厚涂層且其表面水抽盡后，倒入發(fā)酵液，在不換硅藻土濾層的情況下，連續(xù)抽濾3次。硅藻土也可作為助濾劑，將硅藻土與發(fā)酵液進(jìn)行混合后再進(jìn)行過(guò)濾，添加量分別為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L。將沒(méi)有添加硅藻土的發(fā)酵液作為對(duì)照，取少量發(fā)酵液8000r/min，離心5min，除菌體和雜質(zhì)得到上清液，采用1.3.4 節(jié)和1.3.5 節(jié)的方法比較抽濾和離心對(duì)除雜蛋白質(zhì)和除菌效果的影響，同時(shí)采用1.4.3節(jié)中的AP-3測(cè)定方法計(jì)算回收率，比較兩種方法對(duì)AP-3含量的影響。

（2）不同pH對(duì)發(fā)酵液雜蛋白質(zhì)、AP-3含量的影響 考察不同酸性條件下pH 分別為2、3、4、5、6時(shí)的除蛋白質(zhì)率及回收率，考察不同pH對(duì)發(fā)酵液雜蛋白質(zhì)、AP-3含量的影響。

（3）發(fā)酵液脫色波長(zhǎng)的確定 發(fā)酵液成分復(fù)雜，將抽濾所得發(fā)酵液，稀釋成不同濃度，分別在波長(zhǎng)380nm、400nm、420nm、440nm、460nm處測(cè)其吸光度，繪制圖譜，選擇線性關(guān)系最好的波長(zhǎng)作為測(cè)定AP-3發(fā)酵液色素的最佳波長(zhǎng)[15]。

（4）活性炭吸附條件的優(yōu)化 采用單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分別考察活性炭添加量（1g/L，5g/L，10 g/L，15g/L，20g/L）、吸附溫度（30～70℃）、吸附時(shí)間（0～150min）對(duì)濾液色度以及AP-3 含量的影響。

（5）活性炭吸附安絲菌素的脫附 收集吸附安絲菌素發(fā)酵液的活性炭于錐形瓶中，加入不同種類的有機(jī)溶劑洗脫液后，密封，室溫下震蕩洗脫，靜置后過(guò)濾洗脫液，測(cè)其安絲菌素P-3含量。

1.4.2 中性氧化鋁柱層析

將上述洗脫液進(jìn)行減壓旋蒸濃縮呈浸膏狀后加入其質(zhì)量1.2～1.5倍的中性氧化鋁（200～300目），然后加入適量乙酸乙酯后使兩者混合均勻，減壓旋蒸后，得到柱層析所需上樣樣品，濕法裝柱后干法上樣，再進(jìn)行梯度洗脫，收集含有AP-3 的洗脫液后，減壓旋蒸濃縮后，甲醇（HPLC 級(jí)）定容后過(guò)0.45μm濾膜，4℃保存待測(cè)。

1.4.3 重結(jié)晶

用少量正己烷溶解上述純化AP-3濃縮品，然后超聲至白色混濁物出現(xiàn)，最后在4℃下靜置5～24h使其重結(jié)晶，如此反復(fù)得到純度較高的AP-3。

1.4.4 質(zhì)譜（MS）

用含有0.1%甲酸的50%甲醇溶液溶解重結(jié)晶后的樣品后，選擇H+、Na+和K+離子測(cè)試。

1.4.5 核磁共振（NMR）

將重結(jié)晶后的高純樣品溶于0.5mL的氘代氯仿中，裝入干凈的核磁管中，在300MHz下測(cè)H1NMR。

1.5 結(jié)晶

將脫色過(guò)程中收集的流出液減壓濃縮再結(jié)晶，得到白色粉狀結(jié)晶物，置于真空干燥箱中50～60℃烘干后得到結(jié)晶。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

2.1.1 硅藻土添加量的影響

由圖3可知，用涂有硅藻土涂層的抽濾裝置進(jìn)行抽濾時(shí)，發(fā)現(xiàn)抽濾效果比離心效果要好，但是回收率較低，這可能是因?yàn)楣柙逋磷鳛槲絼┏宋桨l(fā)酵液中的菌體和雜蛋白質(zhì)，還會(huì)吸附部分AP-3，使得回收率降低。通過(guò)離心去除菌絲體后乙酸乙酯直接萃取上清液中的AP-3 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量降低，推測(cè)可能是因?yàn)榫z體較黏吸附了部分AP-3，乙酸乙酯直接萃取上清液會(huì)損失部分菌絲體上的AP-3。硅藻土除了作為吸附劑外，還可作為助濾劑，添加不同濃度的硅藻土發(fā)現(xiàn)不僅除雜蛋白質(zhì)率有所提高，AP-3 的回收率也有提高，這與其他文獻(xiàn)研究結(jié)果相似[16]。在10g/L 時(shí)，回收率達(dá)到最大，因此本文作者選擇10g/L作為硅藻土的添加量，此時(shí)除菌率為89.85%，除雜蛋白質(zhì)率為54.12%，回收率為96%。

圖3 硅藻土添加量對(duì)發(fā)酵液中雜質(zhì)的影響

2.1.2 不同pH 對(duì)發(fā)酵液中雜蛋白質(zhì)、AP-3 含量的影響

由圖4可知，pH為2時(shí)，蛋白質(zhì)析出最多，除蛋白質(zhì)率最高。隨著pH 升高，除蛋白質(zhì)率逐漸降低，說(shuō)明酸性條件下蛋白質(zhì)更易變性沉淀，pH為3時(shí)AP-3的回收率達(dá)到最大，隨后隨著pH的提高逐漸降低，AP-3 在弱酸性條件下更易溶于乙酸乙酯中，可能是因?yàn)閜H 下降，黏度下降，菌體纏繞AP-3能力降低，使得菌絲體上AP-3更易被萃取出來(lái)[17]。當(dāng)pH 為2 時(shí)，AP-3 產(chǎn)量降低，可能是強(qiáng)酸性條件下AP-3不易溶于有機(jī)溶劑[18]，使得AP-3萃取量降低。因此選擇pH 為3 時(shí)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行雜蛋白質(zhì)預(yù)處理，此時(shí)除雜蛋白質(zhì)率為68.2%，回收率為83.8%。

2.1.3 發(fā)酵液脫色波長(zhǎng)的確定

發(fā)酵液濃度與吸光度關(guān)系見(jiàn)圖5及表1。

圖5 脫色波長(zhǎng)的確定

表1 不同波長(zhǎng)下的相關(guān)系數(shù)

由表1可知，波長(zhǎng)420nm時(shí)線性系數(shù)最好，故后續(xù)步驟用420nm作為活性炭脫色檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 活性炭質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵液的影響

添加濃度1～2g/L 的活性炭，在恒溫水浴60℃下加熱1h后，離心取上清液測(cè)其脫色率及吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 活性炭加入量對(duì)發(fā)酵液的影響

由圖6可知，隨著活性炭用量增加，脫色率不斷增加，增加到一定程度之后就趨向穩(wěn)定，是因?yàn)榛钚蕴繉儆谖锢砦剑?dāng)吸附到一定程度之后其內(nèi)部達(dá)飽和狀態(tài)，很難再吸附色素。隨著活性炭質(zhì)量濃度的增加，脫色率顯著增加，回收率明顯升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為20g/L 時(shí)，回收率劇增，發(fā)酵液已幾近無(wú)色，于是選擇20g/L 濃度活性炭，此時(shí)脫色率達(dá)93.06%，吸附率達(dá)90.31%。

2.1.5 溫度及脫色時(shí)間對(duì)脫色效果影響

由圖7可知，溫度升高能減小體系的黏度，加速分子的熱運(yùn)動(dòng)，促使色素分子間碰撞機(jī)會(huì)增加，有利于加速活性炭對(duì)色素的吸附作用；隨著脫色溫度的升高，發(fā)酵液脫色率逐漸增大，60℃后沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，說(shuō)明活性炭對(duì)色素的吸附達(dá)飽和狀態(tài)，此時(shí)脫色率為91.63%。AP-3 的回收率隨著溫度的升高逐漸緩慢降低，但是變化不大，說(shuō)明活性炭吸附已趨于平衡狀態(tài)，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)回收率明顯降低，可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致安絲菌素降解。于是選擇60℃下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行活性炭脫色處理，此時(shí)吸附率達(dá)89.45%。

圖7 脫色溫度對(duì)發(fā)酵液的影響

由圖8可知，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率升高，表明被吸附物質(zhì)與活性表面接觸機(jī)會(huì)越多[19]，當(dāng)脫色時(shí)間到達(dá)2h 時(shí)，安絲菌素被全部吸附，大部分色素被全部脫除，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)活性炭吸附達(dá)到平衡狀態(tài)，脫色率為93.12%，得率100%，于是選擇2h作為脫色最佳時(shí)間。

圖8 脫色時(shí)間對(duì)發(fā)酵液的影響

2.1.6 安絲菌素洗脫劑的選擇

由表2可知，選取上述三種有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有乙酸乙酯未有色素洗脫出來(lái)。推測(cè)可能色素吸附在活性炭?jī)?nèi)部，孔道內(nèi)有水阻隔色素與乙酸乙酯接觸，上述洗脫劑中，安絲菌素更易溶于乙酸乙酯，導(dǎo)致安絲菌素較色素更易被洗脫出來(lái)。

2.1.7 安絲菌素洗脫時(shí)間的選擇

活性炭的吸附與脫附同時(shí)進(jìn)行，在一定時(shí)間下會(huì)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

表2 不同洗脫劑對(duì)活性炭吸附安絲菌素的洗脫效果

由圖9 可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AP-3 的洗脫率逐漸增大，當(dāng)達(dá)到2h 時(shí)，安絲菌素的洗脫率不再發(fā)生變化，說(shuō)明已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，于是選擇2h作為洗脫時(shí)間，此時(shí)AP-3的洗脫率為81.28%。

圖9 活性炭吸附安絲菌素的洗脫過(guò)程

2.2 中性氧化鋁柱層析結(jié)果

由表3可知，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理后，更易進(jìn)行中性氧化鋁柱層析，消耗有機(jī)溶劑總體積720mL（溶劑用量327mL/mg 產(chǎn)物），與文獻(xiàn)[20]直接柱層析后消耗有機(jī)溶劑1680mL（溶劑用量763mL/mg產(chǎn)物）相比，其消耗體積顯著降低，可見(jiàn)極性較大的物質(zhì)并未完全分離出來(lái)，但是含量相對(duì)減少，此時(shí)AP-3純度86.15%，洗脫率80.36%。

表3 中性氧化鋁柱層析梯度洗脫消耗溶劑體積

2.3 質(zhì)譜（MS）與核磁共振（NMR）結(jié)果

分離純化后再重結(jié)晶得到AP-3 純品，經(jīng)過(guò)HPLC 檢測(cè)得到其純度達(dá)95%，AP-3 總體收率為78.5%，溶劑用量為347mL/mg AP-3。因此對(duì)其進(jìn)行了MS 和1H NMR 分析（如圖10），ESI 質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯 示，[M+H]+(m/z)為635.27，[M+Na]+(m/z) 為657.26，[M+K]+(m/z)為701.49，證明發(fā)酵產(chǎn)物提取分離得到的確為AP-3。

3 結(jié)論

圖10 純化所得AP-3的MS、1H NMR圖

為了提高分離純化AP-3 的效率，本研究通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，以除去發(fā)酵液中的雜蛋白質(zhì)及色素。本文用抽濾的方法代替了傳統(tǒng)的離心方法，有效地去除了發(fā)酵液中的菌體雜質(zhì)等。通過(guò)酸化發(fā)酵液，去除發(fā)酵液中的大量雜蛋白質(zhì)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了有效預(yù)處理，同時(shí)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察活性炭吸附發(fā)酵液中色素的最佳條件，采用乙酸乙酯脫附來(lái)達(dá)到快速分離純化的目的。除此之外，發(fā)現(xiàn)活性炭還可以重復(fù)利用，選取的脫附劑乙酸乙酯相較于其他有機(jī)試劑其毒性也小，此時(shí)AP-3的洗脫率為81.28%。最后采用中性氧化鋁柱層析，消耗有機(jī)溶劑總體積720mL，洗脫率80.36%，此時(shí)AP-3 純度86.15%。分離純化后的AP-3 經(jīng)重結(jié)晶后其純度可達(dá)95%以上，經(jīng)過(guò)MS 和1H NMR 分析可確定發(fā)酵產(chǎn)物提取分離得到的確為AP-3。本文從多角度研究純化安絲菌素P-3的方法，該方法既快速又環(huán)保。另外本文為快速分離純化安絲菌素也提供了新的方法及思路。