miR-328、miR-147和miR-22在慢性心力衰竭病人中的表達(dá)變化及臨床意義

費(fèi)松柏1，陳小霞1，馬可忠，劉 娟

心力衰竭是由心肌損傷所致的心臟結(jié)構(gòu)與功能改變的臨床綜合征，是大部分心血管疾病發(fā)展的終末期，一旦出現(xiàn)心力衰竭癥狀，病人的生存期和多數(shù)惡性腫瘤病人相似[1-2]。若能夠早期識(shí)別診斷“前臨床心衰階段”并及時(shí)干預(yù)，或許能改善慢性心力衰竭病人的預(yù)后[3]。微小RNA(miRNA)是一種真核細(xì)胞胞質(zhì)中不編碼蛋白的小RNA分子，含有18～25個(gè)堿基。miRNA發(fā)揮作用的機(jī)制是以種子系列中的2-7nt序列來(lái)配對(duì)靶mRNA 3′端非翻譯區(qū)的片段，進(jìn)而識(shí)別靶mRNA而發(fā)揮作用[4]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA在心血管疾病中表達(dá)水平異常，參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。慢性心力衰竭作為大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，miRNA可能在慢性心力衰竭中表達(dá)異常，對(duì)該病的早期診斷、治療及預(yù)后判斷中有重要價(jià)值。馮榮等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-328、miR-22及 miR-147在冠心病病人中存在異常表達(dá)，可能成為冠心病疾病診斷及治療的新靶點(diǎn)。但上述3個(gè)miRNA是否參與了慢性心力衰竭的發(fā)病尚未見研究報(bào)道?；诖?，本研究擬選慢性心力衰竭病人與健康查體者進(jìn)行對(duì)照研究，分析兩組miR-328、miR-147和miR-22表達(dá)差異及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取鄖西縣人民醫(yī)院2017年6月—2018年6月收治的62例慢性心力衰竭病人設(shè)為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)2007年制定的《慢性心力衰竭診斷治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為慢性心力衰竭；②美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì) (NYHA)心功能分級(jí)在Ⅱ～Ⅳ級(jí)；③心臟彩超檢查顯示，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<50%；④病程超過(guò)1年，且經(jīng)治療后病情已穩(wěn)定；⑤2周內(nèi)未服用任何抗血小板、抗血栓等藥物；⑥納入對(duì)象之間均無(wú)親屬血緣關(guān)系；⑦簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并多臟器功能衰竭者；②合并血液系統(tǒng)疾病者；③合并惡性腫瘤者；④合并糖尿病、全身急慢性感染者；⑤合并肝功能異常者；⑥合并出血性疾病者。另選同期62名健康查體者設(shè)為對(duì)照組。研究組年齡52～79歲，對(duì)照組年齡50～78歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及質(zhì)量鑒定 外周血血漿樣本：抽取外周靜脈血5mL，以3000r/min分離出血漿，再以12 000 r/min分離血漿中的細(xì)胞碎片，繼續(xù)以25 000 r/min分離血漿中細(xì)胞碎片上的核酸，將離心處理后的血漿凍存于-80 ℃冰箱待提取。使用德國(guó)Qiagen 公司生產(chǎn)的miRNeasy試劑盒按照說(shuō)明書提取RNA，使用熒光定量RNA反轉(zhuǎn)錄結(jié)合cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)(RT-PCR)擴(kuò)增SNORD44引物鑒定質(zhì)量，提取的RNA置于-80 ℃冰箱中凍存待測(cè)。外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本：將按1∶1將外周靜脈血與PBS溶液混合，鋪在淋巴細(xì)胞分離液上，1 500 r/min離心處理，離心管出現(xiàn)4層液層后，收集第2層液層用PBS重懸，繼續(xù)以1 000 r/min速率離心處理2次，收集細(xì)胞提取RNA。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng) 使用96孔反應(yīng)板，每個(gè)樣本重復(fù)3次反應(yīng)，取均值。使用美國(guó)GeneCopoeia公司生產(chǎn)的All-in-One miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，擴(kuò)增用羅氏LightCycler 480 Ⅱ擴(kuò)增儀，95 ℃變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s 40次，72 ℃延伸5 min，參照RNU6-2計(jì)算擴(kuò)增的△Ct，確定miRNA表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) ①對(duì)比分析兩組外周血、單核細(xì)胞的miR-328、miR-147和miR-22表達(dá)水平。②比較研究組病人不同心功能分級(jí)的外周血、單個(gè)核細(xì)胞的miR-328、miR-147和miR-22表達(dá)水平。③比較冠心病、風(fēng)濕性心臟病、擴(kuò)張型心肌病所致的慢性心力衰竭病人血漿miR-328、miR-147和miR-22表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用方差分析、t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血漿miRNA表達(dá)水平比較 研究組血漿miR-328、miR-22表達(dá)水平高于對(duì)照組，miR-147表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

組別例數(shù)miR-328miR-22miR-147研究組621.47±0.180.96±0.150.43±0.14對(duì)照組620.46±0.070.49±0.101.04±0.19t值41.17820.528-20.352P0.0000.000 0.000

2.2 兩組單核細(xì)胞中miRNA表達(dá)水平比較 研究組單核細(xì)胞miR-328、miR-22表達(dá)水平高于對(duì)照組，miR-147表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

組別例數(shù)miR-328miR-22miR-147研究組622.87±0.271.66±0.141.34±0.28對(duì)照組622.61±0.181.35±0.094.45±0.31t值6.30914.666-58.621P0.0000.000 0.000

2.3 不同程度慢性心力衰竭病人外周血miRNA表達(dá)水平比較 隨著慢性心力衰竭心功能分級(jí)升高，病人血漿miR-328、miR-22表達(dá)水平顯著升高，miR-147表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

心功能分級(jí)例數(shù)miR-328miR-22miR-147Ⅱ級(jí)191.37±0.150.87±0.140.55±0.19Ⅲ級(jí)201.52±0.17①0.99±0.17①0.37±0.16①Ⅳ級(jí)231.68±0.19①②1.03±0.19①②0.30±0.13①②P<0.05<0.05<0.05

與Ⅱ級(jí)比較，①P<0.05；與Ⅲ級(jí)比較，②P<0.05。

2.4 不同程度慢性心力衰竭單核細(xì)胞miR-328、miR-147和miR-22表達(dá)水平比較 隨著慢性心力衰竭心功能分級(jí)升高，單核細(xì)胞miR-328、miR-22表達(dá)水平顯著升高，miR-147表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表5。

心功能分級(jí)例數(shù)miR-328miR-22miR-147Ⅱ級(jí)192.76±0.371.56±0.111.48±0.26Ⅲ級(jí)202.89±0.41①1.69±0.13①1.34±0.22①Ⅳ級(jí)233.12±0.45①②1.82±0.16①②1.29±0.17①②P<0.05<0.05<0.05

與Ⅱ級(jí)比較，①P<0.05；與Ⅲ級(jí)比較，②P<0.05。

2.5 不同病因所致慢性心力衰竭血漿miRNA表達(dá)水平比較 不同病因所致的慢性心力衰竭病人血漿miR-328、miR-147、miR-22表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表6。

病因例數(shù)miR-328miR-22miR-147冠心病 271.44±0.150.95±0.130.44±0.10風(fēng)濕性心臟病171.49±0.170.97±0.150.40±0.12擴(kuò)張型心肌病181.48±0.140.98±0.160.47±0.11P>0.05>0.05>0.05

2.6 miR-328、miR-147、miR-22表達(dá)水平與腦鈉肽(BNP)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)及LVEF的相關(guān)性 miR-328、miR-147表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-22表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈負(fù)相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見表7。

表7 miR-328、miR-147、miR-22表達(dá)水平與BNP、LVEDD及LVEF的相關(guān)性

2.7 慢性心力衰竭危險(xiǎn)因素分析 miR-328、miR-147、miR-22是慢性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表8。

表8 慢性心力衰竭危險(xiǎn)因素回歸分析

3 討 論

隨著人口老齡化及醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展，心肌梗死救治水平升高，慢性心力衰竭患病率呈不斷升高趨勢(shì)，成為嚴(yán)重威脅中老年人群健康的心血管疾病。慢性心力衰竭病人心室充盈、射血功能異常，臨床表現(xiàn)為乏力、液體潴留、呼吸困難等[8-9]。慢性心力衰竭可分為4個(gè)階段，包括前心力衰竭、前臨床心力衰竭、臨床心力衰竭、難治性終末期心力衰竭[10-11]。臨床上主要以血漿利鈉肽作為輔助診斷心力衰竭的指標(biāo)，但診斷效果并不理想[12]。

miRNA是一種高度保守的非編碼小分子RNA，代謝周期長(zhǎng)，穩(wěn)定性好，適合作疾病標(biāo)志物。miRNA主要通過(guò)與配對(duì)的特殊位點(diǎn)結(jié)合，起到降解靶基因mRNA或間接抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯的作用，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)水平；另外miRNA還具有刺激某些靶基因表達(dá)的作用[13-14]。miRNA具有多重生物學(xué)功能，其參與了細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等一系列過(guò)程，與機(jī)體激素分泌、心血管疾病、糖尿病、腫瘤發(fā)生等關(guān)系密切[15-17]。人miR-328具有雙重調(diào)節(jié)作用，相關(guān)研究表明，急性心肌梗死病人miR-328表達(dá)水平升高[18]。本研究顯示，慢性心力衰竭病人外周血及單核細(xì)胞中的miR-328表達(dá)相對(duì)健康人群顯著升高，且隨著心力衰竭程度加重而增高，其可能原因?yàn)槁孕牧λソ卟∪藱C(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)下，增加miR-328的釋放，使血漿及單核細(xì)胞中檢測(cè)到的miR-328明顯升高。人miR-147是一種與炎癥相關(guān)的miRNA。相關(guān)研究表明，冠心病病人miR-147呈低表達(dá)[19]。本研究中慢性心力衰竭病人血漿及單核細(xì)胞中的miR-147表達(dá)水平相對(duì)健康人群下降，隨著慢性心力衰竭程度加重下降更明顯，提示miR-147可能通過(guò)受損的心肌組織及單核細(xì)胞釋放。miR-22是一種抗凋亡的miRNA，相關(guān)研究顯示miR-22在急性心肌梗死病人中表達(dá)水平升高[18]。本研究顯示，慢性心力衰竭病人血漿及單核細(xì)胞中的miR-22表達(dá)水平均升高，miR-22在血漿及單核細(xì)胞中一致的變化特點(diǎn)提示其可能通過(guò)單核細(xì)胞釋放。miR-147、miR-22、miR-328在慢性心力衰竭病人與健康查體者之間的差異化表達(dá)，有望作為臨床鑒別診斷慢性心力衰竭的標(biāo)志物。同時(shí)，miR-328、miR-147表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)；miR-22表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈負(fù)相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)；miR-328、miR-147、miR-22是慢性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示miR-328、miR-147、miR-22的水平變化反應(yīng)了慢性心力衰竭病人心室重構(gòu)程度，可作為預(yù)測(cè)慢性心力衰竭的重要指標(biāo)。

綜上所述，miRNA具有高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，miR-22、miR-328、miR-147的表達(dá)水平在慢性心力衰竭病人中表現(xiàn)為升高或下降趨勢(shì)，與健康人群差異顯著，miR-328、miR-147、miR-22表達(dá)水平與慢性心力衰竭病人BNP、LVEDD、LVEF存在相關(guān)性，是慢性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望作為慢性心力衰竭診斷及判斷病情的標(biāo)志物。但miRNA檢測(cè)費(fèi)用高昂、循環(huán)次數(shù)多且濃度低，容易出現(xiàn)較大誤差，加上miRNA容易降解，容易造成檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際不符[20-21]。另外miRNA在疾病中的作用尚不完全清楚，諸多問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究解決。