松果菊苷對帕金森病模型大鼠紋狀體GRP78及MANF表達(dá)的影響

陳乃潔，鐘佳男2，唐嵐芳2，劉 婷2，楊莎莎2，許 茜，林 瑤，肖紹堅3，林友寧3，蔡 晶

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要的病理改變?yōu)楹谫|(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的丟失及路易體的形成[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病的發(fā)病機(jī)制與過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)為重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)其表達(dá)增加[2]。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)為一種新型神經(jīng)營養(yǎng)因子，可有效地保護(hù)并修復(fù)中腦多巴胺神經(jīng)元[3]，目前認(rèn)為MANF的功能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系密切[4]。 已有研究發(fā)現(xiàn)，以肉蓯蓉為主要組成成分的中藥復(fù)方對PD有一定治療作用[5]，而松果菊苷(echinacoside，ECH)是肉蓯蓉最主要的有效成分之一[6]。故本研究旨在探討松果菊苷對魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型紋狀體中GRP78及MANF表達(dá)的影響，以明確中藥復(fù)方蓯蓉精治療PD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 魚藤酮、葵花油(美國Sigma公司)；松果菊苷粉末(中國南京景竹公司)；GRP78、MANF抗體(英國abcam公司)，β-actin抗體(武漢三鷹公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克公司)；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；DU-650型蛋白分析儀(美國Beckma公司)；5417R 高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗動物與分組 無特定病原體動物(SPF)級成年健康雄性SD大鼠32只，動物合格證號：SCXK(滬)2018-0004，體質(zhì)量215～245 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供及飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫20～25 ℃，照明時間08：00～20：00，自由攝食與飲水。大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)SPSS軟件隨機(jī)分為正常組、溶劑組及造模組，將造模成功的PD大鼠隨機(jī)分為模型組和治療組，每組8只。

1.3 造模與給藥 魚藤酮加入葵花油配置成濃度為1.5 mg/mL的魚藤酮葵花油乳化液，造模組大鼠予以頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d)，連續(xù)注射2周，1周后休息1 d[7]。溶劑組注射等體積葵花油。造模成功后，治療組采用濃度為2 mg/mL的松果菊苷純水溶液灌胃，治療濃度為20 mg/kg，每日1次，治療2周。其余各組予以等量生理鹽水灌胃。

1.4 行為學(xué)檢測 選一直徑約3 mm的鐵絲線，水平固定于距地面30 cm處。將大鼠懸掛于鐵絲線上，以其前爪攀附，后肢或尾巴掛于線上則重新開始，不可翻坐于線上，記錄其懸掛時間[8]。各組大鼠在松果菊苷治療前1 d及治療14 d后進(jìn)行檢測，每只測量3次，每次間隔約10 min，取均值分析。

1.5 取材 實驗大鼠于藥物干預(yù)14 d后取材。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，于冰盤上取出紋狀體，0.9%氯化鈉冰溶液沖洗除去血液，濾紙吸干，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測GRP78和MANF表達(dá) 取適量大鼠紋狀體組織，加RIPA裂解液備制勻漿組織，離心取上清。勻漿上清用蛋白質(zhì)定量(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。配膠，取出蛋白樣品，水浴鍋中煮沸5 min，將樣品加入SDS-PAGE膠加樣孔中，電泳。取出已電泳完的SDS-PAGE膠放于轉(zhuǎn)膜液中，切取所需目的膠體，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜用TBS搖床緩慢漂洗5 min，再放入5%脫脂奶粉中，室溫下?lián)u床緩慢搖動封閉2 h。封閉完成后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入GRP78、MANF抗體(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜；一抗孵育完成用TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫1 h搖床孵育，再次用TBST洗膜。最后加入ECL顯色劑(化學(xué)發(fā)光底物和穩(wěn)定劑以1∶1混合)反應(yīng)1 min，放置于成像儀內(nèi)進(jìn)行曝光成像，用Image Lab軟件半定量分析并記錄相應(yīng)條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠懸掛試驗結(jié)果比較 治療前，模型組與治療組大鼠懸掛時間明顯短于正常組(P<0.05)。治療14 d后，治療組大鼠懸掛時間較模型組延長(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠懸掛試驗結(jié)果 比較(±s) 單位：s

與同時間正常組比較，①P<0.01；與同時間模型組比較，②P<0.05。

2.2 4組大鼠紋狀體GRP78、MANF蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組GRP78蛋白表達(dá)增高，MANF蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。與模型組比較，治療組GRP78蛋白表達(dá)有所降低，MANF蛋白表達(dá)有所升高(P<0.01)。詳見表2、圖 1。

組別只數(shù)GRP78/β-actinMANF/β-actin正常組80.684 6±0.047 10.612 1±0.012 3溶劑組80.742 8±0.098 70.600 0±0.022 2模型組81.196 4±0.156 2①0.381 5±0.016 9①治療組80.882 4±0.055 0②0.444 3±0.012 0②

與正常組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05。

圖1 4組大鼠紋狀體GRP78、MANF蛋白表達(dá)

3 討 論

PD是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，在我國65歲以上人群的患病率為1 700/10萬人，并隨年齡增長而升高。其核心運(yùn)動癥狀包括：運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直及靜止性震顫，可伴有嗅覺減退或消失、抑郁、睡眠障礙等非運(yùn)動癥狀。其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性丟失及α-突觸核蛋白異常聚集導(dǎo)致路易小體形成，進(jìn)而使紋狀體區(qū)多巴胺遞質(zhì)降低[9]。隨著對PD發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PD發(fā)病中可能起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)的合成、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白負(fù)荷超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力時，就可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常蛋白質(zhì)的沉積，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS可激活未折疊蛋白反應(yīng)，GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，其表達(dá)可反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度[10]。早期未折疊蛋白反應(yīng)可提高細(xì)胞的適應(yīng)性，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重新達(dá)到穩(wěn)態(tài)，但持續(xù)過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘發(fā)ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡[11]。

MANF為一種新型神經(jīng)營養(yǎng)因子，大部分表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，少部分以分泌的形式出現(xiàn)[12]。細(xì)胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，MANF可選擇性地促進(jìn)大鼠胚胎期黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元存活[13]；在大鼠中，MANF可提高刺激誘發(fā)的多巴胺釋放[14]，在PD疾病模型中可有效地保護(hù)并修復(fù)中腦多巴胺神經(jīng)元[3]。目前認(rèn)為MANF的功能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系密切，MANF基因分析提示其啟動子區(qū)域存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)原件(ER stress response element，ERSE)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中，外源性的MANF可抑制α-突觸核蛋白的過表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡[16]。

現(xiàn)代中醫(yī)將帕金森病歸于“顫證”范圍，認(rèn)為其病機(jī)為腎精虧損、腦髓不足，故治法以補(bǔ)腎益髓為主[17]。蓯蓉精方是本課題組通過前期臨床經(jīng)驗總結(jié)和基礎(chǔ)研究總結(jié)出來的復(fù)方，具有補(bǔ)腎益髓的功效，用于治療PD有一定的效果，已申請為國家專利(專利號：2011103028541)。前期臨床研究表明在西藥美多芭治療基礎(chǔ)上加用蓯蓉精方治療早中期PD，效果優(yōu)于單用西藥治療的效果，能有效改善病人的運(yùn)動功能部分評分[18]。實驗研究表明，蓯蓉精水提物及納米微粉均可有效地減少α-突觸核蛋白的聚集，減輕1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞損傷[19]。松果菊苷為蓯蓉精君藥肉蓯蓉的主要成分之一，多項研究表明，松果菊苷可顯著抑制多巴胺神經(jīng)元丟失，維持黑質(zhì)紋狀體多巴胺及其代謝物水平[20]。本研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷干預(yù)后，大鼠的懸掛時間延長，提示松果菊苷可一定程度地改善PD行為障礙；與模型組比較，治療組GRP78蛋白表達(dá)有所降低，MANF蛋白表達(dá)升高，表明松果菊苷可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)，降低GRP78表達(dá)，并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的MANF的表達(dá)，以促進(jìn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的存活。

綜上所述，松果菊苷可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)及增加MANF的表達(dá)以改善PD的運(yùn)動障礙，為探求蓯蓉精治療PD的機(jī)制提供了新的思路，后期可對相關(guān)通路進(jìn)行更深入的探索。